Компьютерная эволюционная биология презентация

биотехнологии 405 гр. Крюкова Екатерина

одним из важнейших методов анализа в молеку­лярной биологии. Предполагается, что в ходе эволюции функция и пространственная структура белков остаются практически постоянными. Это означает, что физико-химические характерис­тики белка, обусловливающие специфическую укладку полипептидной цепи и функциональные особенности белка, в ходе эволюции также дол­жны поддерживаться на постоянном уровне.
Согласно существующим представлениям, возможны три механиз­ма консервативности таких характеристик. Пер­вый механизм обусловлен инвариантностью функционально важных по­зиций белка. Это означает, что любые мутации в них приводят к нару­шению функции белка. Второй механизм обусловлен консервативными заменами амино­кислот в позициях белка. Эти замены происходят таким образом, что физико-химические свойства остатка существенно не меняются. Со­гласно третьему механизму, дополнительный вклад в консервативность могут вносить координированные замены аминокислотных остатков. Это замены в парах или группах позиций белка, которые фиксируются зависимым образом. В последнее время методы выявления и анализа подобных замен интенсивно развиваются. Информация, полученная в ходе анализа парных координированных за­мен, позволяет получать важные данные о структуре и функции белка, предсказывать взаимные контакты остатков и улучшать распознавание типов укладки полипептидных цепей.

мены двух или нескольких аминокислотных остатков в позициях белко­вой последовательности, которые в ходе эволюции фиксируются зави­симым образом. Это означает, что вероятности фиксации различных ти­пов аминокислот в позиции белка i зависят от типа аминокислотного остатка в позиции белка j. Предполагается, что данный режим эволюции пары позиций белка реализуется в случае, если остатки в этих позициях взаимодействуют прямым или опосредованным образом. В качестве примера таких взаимодействий обычно рассматривают стерический контакт остатков.
О заменах остатков, компенсаторных по отношению
к их суммарному объе­му, говорят,
если повреждающий эффект от замены остатка
в одной по­зиции белка может быть скомпенсирован
заменой в другой позиции пос­ледовательности,
так что общий эффект двух замен оказывается
нейт­ральным. Примером замен, компенсаторных
по отношению к суммарному заряду, могут служить замены
остатков, фор­мирующие солевой мостик.

белка зависит от со­вместного набора аминокислот в паре (или группе) позиций, может про­являться в экспериментах по измерению стабильности (активности) белка как неаддитивность эффекта нескольких аминокислотных замен. В частности, если при проведении двойных замен в белковой последовательности об­наружится, что изменение стабильности белка не равно суммарному изменению стабильности, полученному в результате каждой из этих за­мен, то это означает, что между остатками существуют взаимодействия. Яновский и сотрудники проанализировали замены аминокислот в районе активного сайта протеина А триптофан синтетазы и обнаружили, что одиночные замены приводят к потере функциональной активности белка. Однако функция белка может быть восстановлена в результате одновременной замены другого остатка, удаленного на расстояние в 33 позиции по первичной структуре от первого. На основании этих данных авторы предположили, что между двумя удаленными районами полипептидной цепи существу­ют функциональные взаимодействия в структуре белка, и предложили схему этих взаимодействий.

зоне контакта двух субъединиц папаина. Авторами показано, что вклад в стабильность остатков в паре позиций белка 32 и 162, формирующих междоменный контакт, не является аддитивным. Характер изменения стабильности мутантных белков отражал стерические взаимодействия остатков, поскольку замены, которые приводили к сильному изменению суммарного объема боковых групп этих двух ос­татков, являлись дестабилизирующими. Зависимость функции белка от специфического сочетания остатков в нескольких его позициях была также продемонстрирована в работе [Desjarlias, Berg, 1992]. Авторы проанализировали базу данных последо­вательностей ДНК-связывающих доменов типа «цинковый палец» и обнаружили в этих мотивах взаимозависимые замены остатков в трех по­зициях ДНК-связывающей спирали (13-й, 15-й и 16-й). Остатки в этих позициях ответственны за специфическое распознавание сайтов ДНК. Авторы показали, что специфическое распознавание мутантными доме­ нами типа «цинковый палец» двух различных сайтов ДНК зависит не только от типа аминокислотного остатка в позиции 13 (Arg или Gin), но и от типов остатков в двух других позициях последовательности. Более того, для правильного распознавания необходимы специфические соче­тания типов аминокислот в трех этих позициях.

Анализировались три позиции белка в районе петли, связывающей субдомены лизоцима. Последовательности различались по всем трем анализируемым позициям. Были реконструированы белки, представляющие собой вероятные промежуточные формы на пути эволюции от одной последовательности к другой в результате единичных замен. Выяснилось, что 2 из 6 анализируемых мутантов обладают большей термостабильностью, нежели оба белка дикого типа. Это факт указывает на кооперативный характер замен в исследованных позициях лизоцимов.
Мэтью и Фершт анализировали термостабильность тетрамерной формы р53 человека и его мутантных производных. Проводились замены остатков, как единичные, так и множественные, в позициях гидрофобного ядра, которые в белках млекопитающих являются консервативными (позиции 330, 332, 340, 341, 344 и 348).

и анализа координированных замен:
рассматривается набор гомологичных аминокислотных последо­вательностей изофункционального белкового семейства;
предполагается, что все анализируемые белки имеют сходную про­странственную структуру;
по набору последовательностей требуется выявить позиции белка, замены в которых происходят зависимым образом (координированно);
на основании информации о зависимых заменах аминокислот не­ обходимо выявить особенности пространственной структуры и функции анализируемых белков.
Оценка степени зависимости позиций в белке включает несколько подзадач:
выбор меры зависимости аминокислотных замен, оценка значи­мости выявленных корреляций;
учет эволюционной зависимости анализируемых последователь­ностей при оценке значимости выявленных корреляций;
учет дальних корреляций, обусловленных опосредованными взаи­модействиями аминокислотных остатков в белке;
выбор критерия правильности предсказания координированных замен и интерпретация полученных результатов;
выявление групп позиций, замены в которых происходят коорди­нированным образом;
анализ взаимосвязи между зависимыми заменами остатков и их функциональной роли в белках.

В первую входят методы, которые основа­ны на использовании мер корреляции, ориентированных на специфику конкретной задачи. К ним можно отнести анализ паттернов аминокислотных остатков в столбцах множественного выравнивания, анализ частот встречаемости амино­кислотных замен в парах позиций выравнивания и частот одновременных замен остатков в ходе эволюции семейства белков. Во вторую группу входят методы анализа или их модификации, широко известные в статистике. В частности, это работы, основанные на применении теории информации, линейных коэффициентов корреляции физико-химических ха­рактеристик остатков или мер взаимного сходства остат­ков, методы максимального правдоподобия.

позиций последова­тельностей белковых семейств возникает важная проблема. Она состоит в том, что такие последовательности не являются статистическими независимыми. Отсутствие статистической независимости су­щественным образом может сказываться на оценке уровня значимости обнаруженных корреляций. Поэтому филогенетический эффект необходимо учитывать при анализе белковых данных.

корреляций аминокислотных замен некоторые подходы используют меры зависимости, основанные на тео­рии информации. В монографии [Clarke, 1995] для оценки степени за­висимости замен в парах позиций использовалась мера на основе пар­ной информации


где Раi , аj - вероятность (наблюдаемая частота) появления пары амино­кислот типа аi, аj в позициях i, j; Раi - вероятность (наблюдаемая частота) появления остатка типа аi, в позиции i.
Эта мера имеет смысл «взвешенной информации». Вес вклада в величину С для пары аi, аj равен частоте ее встречаемости. Преимущество описанной выше меры обосновывается эмпирическими наблюдениями. Автор ука­зывает, что взвешивание приводит к выявлению большего числа пар позиций, зависимость аминокислотных замен в которых находит при­емлемое структурное или функциональное обоснование. Статистичес­кая значимость величины С определялась в этой работе с помощью перестановочного теста.

Для учета эволюционной зависимости последовательностей анализ проводился в три этапа. На первом этапе вычислялись ковариационные меры С для пар позиций с использованием полной выборки, содержащей 263 последовательности. Затем в парах остатков с наибольшим значением меры С выбирались типы аминокислот, вносящих наибольший вклад в величину С. После­довательности, содержащие данные типы аминокислот в указанных по­зициях, удалялись. Размер новой выборки составил 173 последователь­ности. Для них данная процедура повторялась. В итоге получен набор из 87 последовательностей. В результате выявлено 16 пар остатков с вы­сокими значениями ковариационной меры С. Дальнейший анализ показал, что 2 пары остатков из 16 в структуре гомеодомена формируют солевой мостик (19-30 и 17-52), остатки 31 и 42 образуют взаимоисключающие контакты с сахарофосфатным остовом ДНК. Это означает, что в различных структурах белка с сахарофосфат­ным остовом может контактировать только один из пары остатков 31 и 42.

работе [Korber et al., 1993]. Степень зависимости аминокислотных замен в паре позиций находилась через величину взаимной информации M (i, j):

Величины энтропии для i-й позиции Н(i) и для пары позиций Н(i, j) выражаются следующим образом:


Здесь P (Si) — частота встречаемости аминокислоты типа Si в пози­ции P(Sj,Sj) — частоты встречаемости пары аминокислот Si и s'j в позициях i и j, соответственно. Значимость обнаруженной статистичес­кой зависимости оценивалась на основе перестановочного теста.

которые использовали в качестве меры зависимости сходную величину - сумму взвешенных услов­ных энтропий:

Для оценки значимости полученных зависимостей в работе [Lapedes et al., 1997] предложен подход, использующий численное моделирова­ние для оценки «корректного» порога для величины взаимной парной информации. Проводилась симуляция эволюции белкового семейства согласно модели независимых замен в позициях белка и эволюционно­му дереву анализируемых последовательностей. По распределению величин парной информации оценивалось ее критическое значение, такое, что вероятность наблюдать его для независимых позиций белка будет достаточно низкой. Полученное крити­ческое значение использовалось далее для оценки значимости выявлен­ных зависимостей при анализе реальных данных.

соавторами и Кларк, согласуются с гипотезой о том, что достаточным условием для формирования ядра является гидрофобная природа его остатков, а стерические ограничения при заменах амино­кислот легко компенсируются перестройками белковой глобулы.
Таким образом, при проведении анализа координированных замен необходимо использовать меры зависимости замен, которые по возмож­ности наиболее адекватно отражают взаимодействия аминокислотных остатков. Вместе с тем, требуется учитывать как филогенетические осо­бенности анализируемой выборки, так и опосредованные взаимодействия в белках. Важными моментами такого анализа являются оценка вклада координированных замен в постоянство интегральных физико-химичес­ких характеристик белка, а также сопоставление данных, полученных в ходе корреляционного анализа, с данными о структурно-функциональ­ной организации и эволюции исследуемых белков.

С (ВГС) является основной причиной инфекцион­ ных хронических заболеваний печени. Вирус относит­ся к семейству Flaviviridae, к роду Hepacivirus, к тому же семейству относится ряд вирусов, вызывающих различные тропические лихорадки. Раз­меры вириона, по данным разных методов анализа, составляют около 30-60 нм. У ВГС + РНК геном имеет одну открытую рамку считывания, ограниченную с 5'- и З'-концов некодирующими областями. Открытая рамка считывания кодирует полипептид-поли­протеин, величина которого варьирует у разных изолятов вируса от 3008 до 3037 аминокислотных остатков. Этот полипротеин расщепляется ви­русными и клеточными сигнальными протеазами на структурные и неструктурные белки.


Функциональное изучение белков ВГС за­труднено, так как существуют значительные сложности с культивирова­нием вируса in vitro, а также почти невозможно моделировать заболева­ние на лабораторных животных, поскольку единственным модельным объектом в природе является шимпанзе. Между тем, персистируя в ходе хронической инфекции в организме человека дли­ тельное время, а также отличаясь большой скоростью размножения и высокой мутабильностью своего РНК-генома, популяция вируса обла­дает возможностью, эволюционируя, уходить от иммунного ответа хозя­ина. Другим потенциальным источником изменчивости может служить обмен генетическим материалом с другими популяциями ВГС. Возмож­ность подобного обмена между отдаленными популяциями облегчается высокой подвижностью такого хозяина, как человек. Повышение измен­чивости ВГС чрезвычайно затрудняет борьбу с ним. Поэтому важную роль в изучении ВГС и закономерностей его эволюции играют современные теоретические методы анализа его геномных последовательностей. Одним из таких подходов является сравнительный и эволюцион­ный анализ последовательностей геномов ВГС.

цифрами 1-6, а в пределах генотипа - подтипы, соответствующие основным группам в популяциях в порядке их открытия (а, Ь, с...к). Другим важным методом сравнитель­ного анализа служит выявление режима адаптивной эволюции в последовательностях ВГС, кодирующих белки. Этот подход основан на срав­нении скоростей фиксации синонимических и несинонимических замен в последовательностях ДНК, кодирующих белки. Синонимические замены не приводят к изменениям типов аминокислот в белках, поэто­му при условии отбора по структуре или функции белка они являются нейтральными. Следовательно, значительное увеличение скоростей фиксации несинонимических замен, по сравнению с синони­мическими, является одним из признаков наличия адаптивного отбора. Участки белка, подверженные адаптивному отбору, могут являться функ­ционально значимыми участками молекулы, а адаптивный режим эволюции в целом для гена может свидетельствовать о приобретении дан­ным геном новой функции.
Информация о позициях белков, подверженных дви­жущему отбору, может быть важной как для функционального анализа белков ВГС, так и для оценки перспектив борьбы с ним (поиск мише­ней для фармакологических препаратов, антигенных детерминант для вакцинации и т.д.). Настоящая работа посвящена исследованию адап­тивного режима эволюции белков вируса гепатита С человека, выявле­нию на основе этих данных особенностей их структурно-функциональ­ной организации, характера их взаимодействия с клетками иммунной системы, а также возможностей для их коэволюции в системе «человек- вирус».

данных последовательностей белков ВГС HCV sequence database, доступной по адресу http://hcv.lanl.gov/content/ sequence/HCV. Рассматривались аминокислот­ные и нуклеотидные последовательности, так как для построения каче­ственного филогенетического дерева необходимо аминокислотное вы­равнивание, а для анализа скоростей накопления синонимических и не­ синонимических замен используются нуклеотидные выравнивания. Для анализа требовались выборки размером не менее 25-30 выравниваний последовательностей, имеющих значительную гомологию. Исходя из этого были составлены выборки следующего со­става: 1 (1а + 1с); 2 (2а + 2Ь + 2с); 3 (За + ЗЬ + Зс); 4,5,6 (4а + 4Ь + 4с + 5а + 5Ь + 5с + 6а + 6Ь + 6с). Последняя выборка была объединена из нескольких генотипов, вследствие того, что в базе данных количество по­следовательностей для отдельного генотипа оказалось мало. Отдельно была составлена выборка последовательностей генотипа lb, поскольку это наиболее изученный гено­тип ВГС, для которого существует наибольшее количество данных.

замен ω= dN/ds, где dN- скорость фиксации несинонимических замен на сайт, ds - скорость фиксации синонимических замен на сайт. Предполагалось, что кодон подвержен адаптивному отбору, если ско­рость фиксации синонимических замен ds была меньше скорости фик­сации несинонимических замен dN, т.е. ω > 1. Для оценки параметра со использовался пакет программ PAML. Данный пакет для оценки ω использует метод максимального правдоподобия. Оценка ω производится с использованием моделей эволюции, описываю­щих замены в отдельных кодонах последовательности. Эти модели от­личались наборами параметров (количеством классов кодонов, разным гипотетическим давлением отбора и распределением для классов сай­тов). Мы исследовали различные модели, описывающие замены в ко­донах и реализованные в программе PAML, под номерами от 0 до 9. Анализи­ровали полный набор моделей, предлагаемый программой PAML. Для каждого кодона последовательности оценивалось среднее взвешенное по всем моделям PAML значение константы ω, с учетом значения функции максимального правдоподобия так, что значениям параметра ω в моде­ лях с большим значением функции правдоподобия придавался больший вес. После этого дополнительно оценивали число адаптивных позиций в белках, т.е. число позиций, для которых ω > 1 при р > 0,9. Выравнива­ния последовательностей проводились с помощью программы CLUSTALW. Филогенетические деревья строились с использо­ванием программы РHYML.

нагрузкой.

Для оценки статистической зависи­мости между адаптивным режимом эволюции кодонов и функцией со­ ответствующих аминокислотных остатков был проведен перестановоч­ный тест. В ходе этого теста каждому кодону сопоставлялось два при­ знака. Первый признак S отражал характер замен (адаптивный/нейтраль­ный). Если в какой-либо из исследованных нами моделей величина па­раметра ω превышала 1 с вероятностью более 0,9, то для такого кодона признак режима эволюции принимал значение 1 (адаптивный), в противном случае признак принимал значение 0 (нейтральный). Второй признак F отражал функциональную нагрузку кодона. Если аминокис­лотный остаток принадлежал функциональному сайту, то для такого ко­ дона его значение было равно 1, в противном случае - 0.

Результаты анализа адаптивного режи­ма эволюции для белков вируса гепатита С приведены в таблице. Из этой таблицы видно, что среднее значение константы ω по всем белкам не превышает величину 0,3. Это свидетельствует о том, что в кодирующей части генома ВГС фиксируются преимущественно синонимические замены, т.е. белки ВГС эволюционируют преимущественно под давле­нием стабилизирующего отбора. В ходе эволюции вируса такие факторы, как стабильность и консервативность пространственной структуры этих белков, являются до­минирующими.

иммунного ответа и с функциональными сай­тами, была оценена значимость взаимосвязи между адаптивным режи­мом эволюции и функциональным свойством позиции. Для того чтобы определить вклад каждого из указанных факторов в обеспечение адаптивного режима эволюции, использовался статисти­ческий тест, который позволяет оценить значимость взаимосвязи между адаптивным режимом эволюции и функциональной ролью позиции белка.

эволюции. Белок Core эволюционирует адаптивно в основном под воздействием иммунной системы. В нем вы­ явлено достаточно высокое количество адаптивных позиций и проде­монстрирован высокий уровень значимости взаимосвязи между адаптив­ными позициями и сайтами CTL и рецепторами Т-хелперов. Белки Е1 и Е2 образуют гетеродимер, который экспонирован на по­верхности вирусной мембраны. Считается, что данный гетеродимер опос­редует взаимодействие вируса с клеточными рецепторами на мембранах гепатоцитов и является основной мишенью для воздействия В-клеточных антител в острую фазу болезни. Для белка NS2 в целом не обнаружена существенная взаимосвязь с иммунной системой, хотя отдельные адаптивные позиции избирательно ассоциированы с сайтами или CTL или Т-хелперов. Можно пред­положить, что поскольку NS2 играет важную роль в процессинге по­липротеина, основная часть адаптивно эволюционирующих позиций связана с совершенствованием этой его функции. В белке NS3 выявлено достаточно много позиций, эволюциониру­ющих адаптивно, в то же время из-за большого размера белка их доля остается достаточно низкой. В целом можно утверждать, что для данного белка характерен баланс между интенсивной адаптивной эволюцией, связанной с иммунным ответом, и стабилизирующим отбором, направ­ленным на поддержание консервативной пространственной структуры, обеспечивающей функциональную активность данного белка.

небольшой длины белка для него получена достаточно боль­шая доля позиций, эволюционирующих адаптивно. Уровень значимости взаимосвязи с эпитопами Т-хелперов составляет 98,73 %, совпадений с эпитопами CTL не обнаружено. Белок NS4B в целом очень консервативный, среднее значение со для него составляет 0,087498 - рекордно низкое для белков ВГС. В дан­ ном белке выявлено чрезвычайно мало позиций, эволюционирующих адаптивно, и их доля очень низка, хотя это достаточно протяженный белок и на нем картировано несколько эпитопов CTL и Т-хелперов. Выявленные позиции демонстрируют высокую корреляцию как с эпи­ топами Т-хелперов, так и с CTL. Белок NS5A предположительно является активатором транскрип­ции некоторых генов. Он эволюционирует адаптивно - характерно как высокое число адаптивных позиций, так и их достаточно высокая доля, но уровень значимости взаимосвязи с функциональными сайтами оста­ется незначительным. Белок NS5B является одной из основных мишеней для создания лекарственных препаратов против ВГС. Белок чрезвычайно быстро эволюционирует, в нем выявлено самое большое по сравнению с другими белками вируса число адаптивных позиций. Последние в целом ассоци­ированы с эпитопами как CTL, так и Т-хелперов, обнаружена высокая корреляция между расположением адаптивных позиций и эпитопов. NS5B, так же как и NS5A, фосфорилируется на С-конце, что объясняет достаточно высокую корреляцию с функциональными сайтами.
Таким образом, результаты анализа кодирующих районов генома ВГС позволили выявить адаптивную эволюцию для ряда позиций бел­ков.