Приготовление гистологических срезов. Микротомы и микротомные ножи. Техника резки на микротомах. (Лекция 16) презентация

ошибки и их устранение




Заведующая ПАО ГБУЗ СО «Городская больница № 5, г.Каменск-Уральский» к.м.н Баранова Е.Ю.

заключен образец ткани. Криотомия – это получение тонких срезов из замороженного кусочка ткани при необходимости постановки срочного диагноза (срочная биопсия). Полученный срез (срезы) наносится на предметное стекло для дальнейшего окрашивания и получения гистологического препарата

получить гистологические срезы различной толщины (от 3 до 5-7 микрон)
►По принципу действия различают санные, ротационные, замораживающие (криотомы), вибротомы
В рутинной гистологической практике используются санные и ротационные микротомы

Традиционно лаборанты-гистологи работают на санных микротомах МС-2

Ротационный микротом Sakura SRM200

(оптимальный 13-15 градусов) в зависимости от характера ткани, медленно подводят микротомный нож к блоку и приступают в резанию материала

и не отклеились во время окраски, стекла обрабатывают специальным способом с целью обезжиривания
►Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят в 2-3 % растворе натрия гидрокарбоната (питьевой соды), затем промывают в в течение нескольких часов в проточной воде
►Обработанные таким образом стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в смесь Никифорова (96% этанол+ эфир, пропорция 1:1)
►Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из смеси Никифорова, протирают чистой тканью и складывают в коробки
Для обезжиривания стекол можно использовать хромовую смесь (100 гр бихромата калия, концентрированная серная кислота и 1 литр горячей воды). Стекла выдерживают в ромовой смеси 2-3 дня, затем тщательно промывают в проточной воде в течение 1-2 дней
►Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю
☻В настоящее время используются специальным образом шлифованные предметные стекла с матовой полосой для надписей, не требующие обезжиривания - стекла с адгезивным покрытием!

стекло предварительно смазывают смесью яичного белка с глицерином.
►Свежий яичный белок взвивается столовой вилкой или шпателем до состояния пены
►Фильтруется в течение 24 часов через широкопористый фильтр
►К профильтрованному белку добавляется равный объем глицерина, перемешивается
►В смесь добавляется небольшой кусочек камфары или тимола для консервации
►На сухое обезжиренное предметное стекло капают маленькую каплю белково-глицериновой смеси
►Сухим чистым обработанным спиртом пальцем тщательно растирают смесь по стеклу
►Стекло проводят 2-3 раза над пламенем спиртовки (как при фиксации бактерий), намазанной стороной вверх
►Можно наклеивать парафиновые срезы

ванночку с
теплой (35-40 С) водой, затем выла-
вливают и помещают на подготов-
ленное предметное стекло с помо-
щью изогнутой препаровальной
иглы
►Стекло со срезом подсушивают в
термостате либо на специальных
подсушивающих гистологических
столиках

нож – сложный стальной клин, у которого режущий край имеет еще дополнительную клинкообразную заточку. Длина ножа от 8 до 25 см
Различают - по длине ножа
Малые ножи- 8-13 см, используются для замораживающих микротомов
Средние ножи – 17-20 см, используются для рутинной резки парафиновых блоков
Большие ножи – 25 см и более –используют для получения гистотопографических срезов в научно-исследовательских целях
По форме клина ножа
Прямые – обе стороны ножа плоские – для парафиновых блоков (наиболее удобны и широко распространены)
Плосковогнутые - одна сторона плоская, другая вогнутая
Двояковогнутые – ограничены в применении, подходят только для специальных микротомов
По углу сечения лезвия ножа (по шлифу)
Очень тонкие (ножи группы А) – острый угол заточки и тонкий шлиф – для нежных мягких тканей
Плосковогнутые ножи группы В - для мягких тканей и рутинной работы
Ножи группы С – для парафиновых блоков, плотных тканей

необходимо затачивать

В настоящее время многоразовые микротомные ножи затачивают с помощью специальных аппаратов
Однако, не потеряла актуальность ручная точка и правка микротомных ножей
Используют точильный камень, имеющий форму бруска (желтый – «бельгийский» камень и белый «арканзас»)

►Первым используют «бельгийский» желтый камень, перед заточкой на камень наносится машинное масло или керосин, глицерин, разведенный 70% спиртом. Нож проводят по камню с одного конца на другой, затем поворачивая через обушок, осуществляют движение в обратном направлении. Продолжают заточку на белом камне, имеющем более мелкозернистую поверхность
►Продолжительность заточки зависит от квалификации лаборанта и составляет в среднем от 30 минут до 1 часа, затем проводят правку ножа на ремне, натянутом на деревянную колодку

предметный столик микроскопа и перемещая его так, чтобы режущая кромка проходила через поле зрения объектива микроскопа на малом увеличении . Режущая кромка не должна иметь зазубрин и серповидной выработки и прочих дефектов режущего края
Наклон микротомного ножа и угол резания
При резке кусочков микротомный нож всегда закрепляется в зажиме микротома наклонно, под некоторым углом к горизонтальной плоскости. Нож хорошо режет при правильном наклоне. При слишком горизонтальной установке наклона ножа (тупой угол) – нож будет скользить, не захватывая срезов, при крутом наклоне (острый угол) – нож будет грубо врезаться в блок. Поэтому угол наклона ножа подбирается лаборантом опытным путем (оптимальный угол наклона ножа 13-15 градусов).

Угол резания – острый угол, образуемый пересечением верхней плоскости объекта (парафинового блока) с нижней плоскостью ножа. Наилучший угол резания составляет 15 градусов. Критерием правильной установки угла резания служит получение ровных срезов
На качество резки и угол наклона влияют острота заточки ножа и качество заливки парафинового блока

получении тонких (до 1 мм толщиной) срезов
Проблематичность организации процесса заточки ножа
Дороговизна абразивных материалов, необходимых для заточки
Необходимость закупки дополнительного оборудования для заточки ножей
В настоящее время для работы используются ОДНОРАЗОВЫЕ лезвия

– тугоплавкий парафин, медленно охлаждался при заливке, низкая температура окружающей среды, большой угол наклона ножа
☻Устранение- перед получением среза подышать на блок, изменить угол наклона ножа, перезолить объект
►Залитый материал в процессе резки выпадает из блока
☹ Причина – заливка проводилась холодным парафином, плохая пропитка материала, при проводке остались следы спирта
☻Устранение- перезолить блок, предварительно поместив его в промежуточную среду для удаления спирта
►материал плохо режется или совсем не режется, ткань белесоватого цвета, срезы сморщенные, плохо расправляются
☹ Причина – недостаточное обезвоживание ткани
☻Устранение- блок расплавляют в термостате и пропускают по батарее в обратном порядке до 100% спирта, затем снова заливают по схеме
►Нож как бы подскакивает, проскальзывая над поверхностью блока, не срезает ткань или на срезах образуются поперечные полосы
☹ Причина – переуплотнение или пересушивание материала при фиксации и обезвоживании
☻Устранение- резать материал, поместив на него кусочек льда, если срезы не получаются, материал испорчен! Из архива вырезают новый кусочек ткани и проводят по батарее

прилипают к поверхности ножа, мнутся
☹ Причина – недостаточный угол наклона ножа, высокая температура в помещении, материал залит в легкоплавкий парафин
☻Устранение- изменить угол наклона ножа, перед резкой поместить блок в холодильник, перезолить в более твердый парафин
►Срезы покрыты полосами и легко рвутся
☹ Причина – плохое качество ножа (зазубрины), грязный парафин (плотные соринки), наличие в кусочке кальцинатов (каменистых включений солей кальция), встречающихся в соединительной, хрящевой костной тканях
☻Устранение- передвинуть нож ли сменить его на хорошо заточенный, декальцинировать объект или воспользоваться микротомным ножом для резки плотных тканей
►Срез прилипает к ножу (элетризация)
☹ Причина – статическое электричество
☻Устранение- перед получением среза подышать на блок

- гистолога

Все необходимые рабочие модули для этапа микротомии:
- охлаждающая панель
- нагревательная панель
- ванночка для расправления срезов
- встроенная терморегулируемая водяная баня
- удобное освещение рабочего пространства