- Главная
- Разное
- Дизайн
- Бизнес и предпринимательство
- Аналитика
- Образование
- Развлечения
- Красота и здоровье
- Финансы
- Государство
- Путешествия
- Спорт
- Недвижимость
- Армия
- Графика
- Культурология
- Еда и кулинария
- Лингвистика
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Маркетинг
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Современные методы идентификации микроорганизмов презентация
Содержание
- 1. Современные методы идентификации микроорганизмов
- 2. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ: ПРИНЦИПЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
- 3. ПОКОЛЕНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕКЦИЙ Преципитация в геле
- 4. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) основывается на двух
- 5. В настоящее время метод тИФА используется для
- 6. схема метода
- 7. На второй стадии анализа в лунку вносят
- 11. D-0556 Вектогеп В - HBs-антиген - стрип (комплект 3)
- 12. СОСТАВ НАБОРА
- 13. СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ При работе с исследуемыми сыворотками
- 15. Таблица расхода реагентов
- 20. Для качественного проведения ИФА в планшетах необходимо
- 21. Дополнительно при подготовке образцов, реагентов и проведения
- 22. Микропланшетные анализаторы Анализатор иммуноферментных реакций УНИПЛАН (АИФР-01,
- 23. Микропланшетный ридер 2020 (Anthos Labtec, Австрия)
- 24. Автоматические промыватели планшетов для ИФА Промыватель планшет
- 25. Автоматический промыватель иммунопланшет Stat Fax 2600 (Awareness
- 26. Термошейкеры для ИФА Термошейкер для иммунопланшет PST-60HL
- 27. Современная аппаратура и оснащение бактериологической лаборатории
- 28. Тест-системы для идентификации бактерий На современном этапе
- 29. Широко используются в практических лабораториях диагностические системы
- 30. Этапы проведения идентификации 1 этап. Выделение чистой
- 31. Автоматические приборы для идентификации и определения антибиотикочувствительности
- 32. Идентификация микроорганизмов и определение их чувствительности к
- 33. Общие положения Идентификация основана на анализе изменения
- 34. Сущность метода Работа в анализаторе VITEK 2
- 35. Сущность метода Результаты сканирования подвергаются компьютерной обработке.
- 36. Методы отбора и подготовки проб. Исследуемый материал
- 37. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды Анализатор
- 38. Подготовка к испытанию Перед началом работы необходимо,
- 39. Подготовка к испытанию Выбор карты для исследования
- 40. Проведение испытания Работа в режиме виртуальной кассеты
- 41. Обработка результатов После считывания карт, полученные
- 42. Ограничение метода Корректная идентификация и определение
- 44. VITEK 2 Compact
- 45. VITEK® 2 (Вайтек 2)
- 46. «Санитарно-бактериологические исследования методом разделенного импеданса». МУК 4.2.2578-10
- 47. Методические указания. «Санитарно-бактериологические
- 48. Сущность импедансного метода Методические указания содержат описание
- 49. Предлагаемый метод на основе метода разделенного импеданса
- 50. Импедансная микробиология является непрямым культуральным методом
- 51. Время определения импеданса (IDT) -время, необходимое для
- 52. наибольшее распространение получили приборы серии "БакТрак 4000"
- 53. Прибор "БакТрак" является автоматизированной экспресс-системой для ускоренной
- 54. Приборы "БакТрак" серии 4000 на основе метода
- 55. Бактериологический анализатор БакТрак 4300
- 56. Бактериологический анализатор БиоТрак 4250
- 57. Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и
- 58. Общие положения Автоматический анализатор ТЕМРО предназначен для:
- 59. Количественный учет микроорганизмов основан на методе наиболее
- 60. Автоматический анализатор ТЕМРО состоит из двух блоков
- 61. Определение общего микробного числа Определение основано
- 62. Определение количества E. Coli Определение основано
- 63. Количество продуктов реакции прямо пропорционально численности популяции
- 64. Определение количества бактерий семейства Enterobacteriaceae и колиформ
- 65. В процессе роста бактерии усваивают углеводы, что
- 66. Проведение испытания Определение количества аэробных мезофильных микроорганизмов
- 67. Обработка результатов После считывания карт, полученные
- 68. Ограничение метода Неправильное заполнение карты (пустые
- 69. Станция пробоподготовки внесение образца и питательной среды в карты
- 70. Станция для считывания считывание карт и
- 71. Станция для считывания
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ: ПРИНЦИПЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
Слайд 3ПОКОЛЕНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕКЦИЙ
Преципитация в геле
Реакции агглютинации
-пластинчатые (кровяно-капельная при туляремии,
Хеддльсона при бруцеллезе
-реакции агглютинации развернутые (Видаля, Райта)
-реакции гемагглютаниции (РПГА+РНГА, РГА,РТПГА)
-Ко-агглютинация
-латекс-агглютинация
ИФА
Иммунохромотогафические реакции
-реакции агглютинации развернутые (Видаля, Райта)
-реакции гемагглютаниции (РПГА+РНГА, РГА,РТПГА)
-Ко-агглютинация
-латекс-агглютинация
ИФА
Иммунохромотогафические реакции
Слайд 4Метод иммуноферментного анализа (ИФА) основывается на двух принципиальных научных открытиях.
способность
ферментов и антител или антигенов, прикрепленных к твердой основой (тИФА), сохранять свою функциональную активность, т.е. ферменты могут расщеплять субстрат, антитела связывать антигены, а антигены – антитела.
создании комплекса антитело-фермент (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Аb-F-конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью до 97-99%.
создании комплекса антитело-фермент (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Аb-F-конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью до 97-99%.
Слайд 5В настоящее время метод тИФА используется для определения широкого класса веществ:
гормонов,
онкомаркеров,
лекарственных препаратов в крови больного (так называемый, мониторинг лекарственных препаратов),
наркотиков,
бактерий,
вирусов и антител против них,
определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность),
а также идентификация лимфоцитов (субпопуляций).
Слайд 7На второй стадии анализа в лунку вносят Ab с заранее прикрепленным
к ним ферментом, способные связаться с Ab человека, закрепившимися на инфекционном агенте. Это так называемый конъюгат. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то возникает “молекулярная цепочка”, на конце которой находится фермент.
На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества — хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом
То есть, если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс
Слайд 13СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
При работе с исследуемыми сыворотками и контрольными образцами следует соблюдать
меры предосторожности, принятые при работе с потенциально инфекционным материалом:
работать в резиновых перчатках;
не пипетировать растворы ртом;
все использованные материалы подвергать обработке 6%-ным раствором перекиси водорода (не менее 6 часов).
Внимание! Несоблюдение описанных требований может привести к искаженному результату ИФА.
Для приготовления растворов и проведения ИФА следует использовать чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5%.
Желательно использовать свежеотобранные образцы сыворотки (плазмы) крови. Допускается использование образцов, хранившихся при (2-8)°С не более 5 суток, либо при минус 20 ±3°С не более 1 мес.
Нельзя использовать проросшие, гиперлипидные сыворотки или подвергавшиеся многократному замораживанию и оттаиванию.
работать в резиновых перчатках;
не пипетировать растворы ртом;
все использованные материалы подвергать обработке 6%-ным раствором перекиси водорода (не менее 6 часов).
Внимание! Несоблюдение описанных требований может привести к искаженному результату ИФА.
Для приготовления растворов и проведения ИФА следует использовать чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5%.
Желательно использовать свежеотобранные образцы сыворотки (плазмы) крови. Допускается использование образцов, хранившихся при (2-8)°С не более 5 суток, либо при минус 20 ±3°С не более 1 мес.
Нельзя использовать проросшие, гиперлипидные сыворотки или подвергавшиеся многократному замораживанию и оттаиванию.
Слайд 20Для качественного проведения ИФА в планшетах необходимо современное лабораторное оборудование, позволяющее
стандартизировать и контролировать все этапы иммуноанализа:
автоматические анализаторы (синоним: спектрофотометры вертикального сканирования, ридеры) для 96-луночных планшетов с вертикальной фотометрией;
программируемые промыватели планшетов (вошеры);
программируемые вибротермостаты для планшетов (синонимы: термостатируемые шейкеры, термошейкеры, шейкер-термостаты).
автоматические анализаторы (синоним: спектрофотометры вертикального сканирования, ридеры) для 96-луночных планшетов с вертикальной фотометрией;
программируемые промыватели планшетов (вошеры);
программируемые вибротермостаты для планшетов (синонимы: термостатируемые шейкеры, термошейкеры, шейкер-термостаты).
Слайд 21Дополнительно при подготовке образцов, реагентов и проведения ИФА используются:
ротаторы -
устройства для оптимального перемешивания крови с добавками в пробирках и стандартизации условий подготовки образцов к анализу;
центрифуги - для отделения сыворотки или плазмы крови;
дозирующие устройства - полуавтоматические пипетки фиксированного и переменного объема (одноканальные, 8- и 12-канальные);
первичные пробирки или системы для забора венозной и капиллярной крови; подробнее
вторичные пробирки, в которых хранится исследуемый образец;
вспомогательное общелабораторное оборудование (вортексы, миксеры, рН-метры, системы для очистки воды и др.). подробнее
центрифуги - для отделения сыворотки или плазмы крови;
дозирующие устройства - полуавтоматические пипетки фиксированного и переменного объема (одноканальные, 8- и 12-канальные);
первичные пробирки или системы для забора венозной и капиллярной крови; подробнее
вторичные пробирки, в которых хранится исследуемый образец;
вспомогательное общелабораторное оборудование (вортексы, миксеры, рН-метры, системы для очистки воды и др.). подробнее
Слайд 22Микропланшетные анализаторы
Анализатор иммуноферментных реакций УНИПЛАН (АИФР-01, Пикон, РФ).
Микропланшетный фотометр Immunochem-2100 (НTI,
США).
Слайд 23Микропланшетный ридер 2020 (Anthos Labtec, Австрия)
Микропланшетный ридер 2010 (Anthos Labtec, Австрия).
Микропланшетный
фотометр Multiskan ЕХ (Termo Fisher Scintific).
Слайд 24Автоматические промыватели планшетов для ИФА
Промыватель планшет автоматический ПРОПЛАН (Пикон, РФ).
Автоматический промыватель
иммунопланшет ImmunoChem-2600 (США).
Слайд 25Автоматический промыватель иммунопланшет Stat Fax 2600 (Awareness Technology, США).
Автоматическое промывочное устройство
Fluido 96W2 (Anthos Labtec, Австрия).
Автоматический промыватель Wellwash 4 MK II (TermoFisher Scientific).
Автоматический промыватель Wellwash 4 MK II (TermoFisher Scientific).
Слайд 26Термошейкеры для ИФА
Термошейкер для иммунопланшет PST-60HL (Biosan, Латвия).
Термошейкер Immunochem-2200.4 (НTI, США)
Цифровой
шейкер-термостат ST-3М (ELMI, Латвия).
Слайд 28Тест-системы для идентификации бактерий
На современном этапе для биохимической идентификации микроорганизмов используют
готовые тест-системы.
Коммерческие тест-системы - это готовые полистероловые планшеты с сухими дифференциальными средами или субстратами.
Коммерческие тест-системы - это готовые полистероловые планшеты с сухими дифференциальными средами или субстратами.
Слайд 29Широко используются в практических лабораториях диагностические системы AРI (фирмs производители:«bio Merieux»
(Франция), «Becton Dickinson» и « Micro Scan» (США), «Micro Tax» - фирма производитель «Sy Lab» (Австрия))
С помощью тест-систем идентификация бактерий проводится в течение 3 - 48ч.
СИБ - системы индикаторных бумажек и одноразовых диагностических пластин для идентификации энтеробактерий и стафилококков (НИИЭМ «Диагностические системы»)
С помощью тест-систем идентификация бактерий проводится в течение 3 - 48ч.
СИБ - системы индикаторных бумажек и одноразовых диагностических пластин для идентификации энтеробактерий и стафилококков (НИИЭМ «Диагностические системы»)
Слайд 30Этапы проведения идентификации
1 этап. Выделение чистой культуры.
2 этап. Подготовка бактериальной суспензии.
3 этап. Инокуляция культуры в лунки планшета.
4 этап. Оценка результатов
5 этап. Идентификация культуры.
Данные этапы проводятся в соответствии с инструкцией производителя.
Слайд 32Идентификация микроорганизмов и определение их чувствительности к антибиотикам с применением автоматического
микробиологического анализатора VITEK 2 Compact
Методические рекомендации
МР 02.032-08
Слайд 33Общие положения
Идентификация основана на анализе изменения биохимических субстратов под действием микроорганизмов.
Определение чувствительности производится на основании подавления роста микроорганизмов под действием различных концентраций антибиотиков. При этом определяются минимальные ингибирующие концентрации (МИК) антибиотиков, которые выражаются в мг/л и интерпретируются в виде категорий «устойчив», «чувствителен», «умеренно-устойчив».
Слайд 34Сущность метода
Работа в анализаторе VITEK 2 Compact проводится с чистой культурой
микроорганизма.
В качестве расходных материалов используются пластиковые карты, содержащие биохимические субстраты (ID-карты, карты для идентификации) или антибиотики в различных концентрациях (AST-карты, карты для определения чувствительности).
Карты под вакуумом, создаваемом анализатором, в автоматическом режиме заполняются суспензией чистой культуры микроорганизмов, запаиваются и помещаются в карусель, где они инкубируются и регулярно (каждые 15 минут) сканируются оптической системой анализатора.
Для считывания ID-карт используется колориметрия (анализатор содержит 2 оптических модуля и использует волны 660, 428 и 568 нанометров)
для считывания AST-карт – турбидиметрия (фиксируются изменение плотности микробной суспензии под влиянием антибиотика).
В качестве расходных материалов используются пластиковые карты, содержащие биохимические субстраты (ID-карты, карты для идентификации) или антибиотики в различных концентрациях (AST-карты, карты для определения чувствительности).
Карты под вакуумом, создаваемом анализатором, в автоматическом режиме заполняются суспензией чистой культуры микроорганизмов, запаиваются и помещаются в карусель, где они инкубируются и регулярно (каждые 15 минут) сканируются оптической системой анализатора.
Для считывания ID-карт используется колориметрия (анализатор содержит 2 оптических модуля и использует волны 660, 428 и 568 нанометров)
для считывания AST-карт – турбидиметрия (фиксируются изменение плотности микробной суспензии под влиянием антибиотика).
Слайд 35Сущность метода
Результаты сканирования подвергаются компьютерной обработке.
По завершении идентификация анализатор найдет в
базе данных соответствие тестируемому микроорганизму или проведет определение чувствительности к антибиотикам, после чего карта сбрасывается в специальный приемник.
Слайд 36Методы отбора и подготовки проб.
Исследуемый материал инокулируется на питательные среды согласно
методам микробиологических исследований, утвержденных в установленном порядке.
Чашки инкубируются 18-24 (48) ч до получения изолированных колоний.
Колонии микроорганизмов для исследования на VITEK 2 Compact рекомендуется брать с неселективных питательных сред.
Используется только чистая культура микроорганизмов.
Чашки инкубируются 18-24 (48) ч до получения изолированных колоний.
Колонии микроорганизмов для исследования на VITEK 2 Compact рекомендуется брать с неселективных питательных сред.
Используется только чистая культура микроорганизмов.
Слайд 37Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды
Анализатор Vitek 2 Compact
Суспензиальный раствор (0,45%
раствор хлорида натрия)
Диспенсер суспензиального раствора
Пластиковые пробирки для анализатора Vitek 2 Compact
Карты для идентификации
Карты для определения чувствительности
Петли бактериологические
Тампоны стерильные
Денситометр
Диспенсер суспензиального раствора
Пластиковые пробирки для анализатора Vitek 2 Compact
Карты для идентификации
Карты для определения чувствительности
Петли бактериологические
Тампоны стерильные
Денситометр
Слайд 38Подготовка к испытанию
Перед началом работы необходимо, следуя инструкциям программного обеспечения, ввести
информацию об используемых AST-картах, а также произвести ряд общих настроек
Чистая культура (материал одной или нескольких изолированных колоний) с помощью бактериологической петли или тампона вносится в пластиковую пробирку с суспензиальным раствором и гомогенизируется там до достижения требуемой плотности бактериальной суспензии:
для грамположительных и грамотрицательных бактерий: 0,5-0,63 McF*,
для прихотливых бактерий: 2,7-3,3 McF,
для бацилл 1,8-2,2 McF,
для грибов: 1,8-2,2 McF.
Чистая культура (материал одной или нескольких изолированных колоний) с помощью бактериологической петли или тампона вносится в пластиковую пробирку с суспензиальным раствором и гомогенизируется там до достижения требуемой плотности бактериальной суспензии:
для грамположительных и грамотрицательных бактерий: 0,5-0,63 McF*,
для прихотливых бактерий: 2,7-3,3 McF,
для бацилл 1,8-2,2 McF,
для грибов: 1,8-2,2 McF.
Слайд 39Подготовка к испытанию
Выбор карты для исследования производится:
на основании окраски по
грамму или пробы с КОН, позволяющей разделить бактерии на грамположительные и грамотрицательные.
Карты VITEK 2 GP (грам-положительные) и VITEK 2 GN (грам-отрицательные).
Микроорганизмы, прихотливые к условиям культивирования (нейссерии, гемофилы и проч.) идентифицируются при помощи карт VITEK 2 NH,
грибы – карт VITEK 2 YST.
карты VITEK 2 BCL предназначены для идентификации микроорганизмов рода Bacillus.
Пробирки с суспензиями устанавливаются в кассету, напротив них в специальные прорези (слоты) устанавливаются соотвествующие карты, так, чтобы относящаяся к карте пластиковая трубочка была погружена в пробирку.
Карты VITEK 2 GP (грам-положительные) и VITEK 2 GN (грам-отрицательные).
Микроорганизмы, прихотливые к условиям культивирования (нейссерии, гемофилы и проч.) идентифицируются при помощи карт VITEK 2 NH,
грибы – карт VITEK 2 YST.
карты VITEK 2 BCL предназначены для идентификации микроорганизмов рода Bacillus.
Пробирки с суспензиями устанавливаются в кассету, напротив них в специальные прорези (слоты) устанавливаются соотвествующие карты, так, чтобы относящаяся к карте пластиковая трубочка была погружена в пробирку.
Слайд 40Проведение испытания
Работа в режиме виртуальной кассеты
Работа в режиме «Загрузил и пошел»
Внесение
даных об образце
Слайд 41Обработка результатов
После считывания карт, полученные результаты анализируются программным обеспечением.
Результаты
исследования карт можно просмотреть (распечатать) в соответствующем окне интерфейса.
Слайд 42Ограничение метода
Корректная идентификация и определение чувтствительности с использованием анализатора VITEK
2 Compact возможны только для микроорганизмов, имеющих клиническое значение.
Слайд 47 Методические указания.
«Санитарно-бактериологические исследования методом разделенного импеданса». МУК
4.2.2578-10
(введены взамен МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора "БакТрак 4100" и методических указаний "Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-бактериологического исследования объектов окружающей среды", 2005 г.
(введены взамен МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора "БакТрак 4100" и методических указаний "Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-бактериологического исследования объектов окружающей среды", 2005 г.
Слайд 48Сущность импедансного метода
Методические указания содержат описание метода ускоренного микробиологического исследования продовольственного
сырья, пищевых продуктов и других объектов внешней среды с использованием микробиологических экспресс-анализаторов, регистрирующих изменения электрического сопротивления (импеданса) питательной среды, происходящего под влиянием процессов роста и жизнедеятельности микроорганизмов в исследуемой пробе.
Слайд 49Предлагаемый метод на основе метода разделенного импеданса позволяет получать быстрые (в
течение нескольких часов) и надежные результаты для большого числа одновременно исследуемых образцов.
Импеданс - сопротивление потоку переменного тока через проводящий материал; является функцией активной проводимости, емкостного сопротивления и применяемой частоты.
Импеданс - сопротивление потоку переменного тока через проводящий материал; является функцией активной проводимости, емкостного сопротивления и применяемой частоты.
Слайд 50Импедансная микробиология является непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов с использованием
определения электрического импеданса.
Изменения импеданса обычно происходят в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов.
Экспоненциальные изменения импедансного сигнала могут наблюдаться, когда количество микроорганизмов достигает порога около106 - 107 клеток/мл.
Изменения импеданса обычно происходят в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов.
Экспоненциальные изменения импедансного сигнала могут наблюдаться, когда количество микроорганизмов достигает порога около106 - 107 клеток/мл.
Слайд 51Время определения импеданса (IDT) -время, необходимое для достижения значимого изменения импеданса
Значение IDT обратно пропорционально начальной концентрации микроорганизмов в исследуемой пробе.
Ход кривых импедансного сигнала соответствует и отражает кривую роста микроорганизмов в исследуемой пробе.
Ход кривых импедансного сигнала соответствует и отражает кривую роста микроорганизмов в исследуемой пробе.
Слайд 52наибольшее распространение получили приборы серии "БакТрак 4000" производства фирмы "SY-LAB Gerate
GmbH" (Австрия).
Приборы "БакТрак 4300", "БакТрак 4100" и "БакТрак 4250", внесены в Реестр средств измерений как кондуктометрические анализаторы для микробиологических исследований.
Метод, основанный на измерении импеданса, приборы "БакТрак 4300", "БакТрак 4100" и "БакТрак 4250", внесены в Национальные стандарты ряда европейских стран: Германии - DIN 10115, 10120, 10121, Австрии - ONORM 10115, 10120, 10121, Франции - AFNOR NF V08-105 (Микробиология продуктов питания и кормов: указания по импедансному методу для микробиологических исследований), AFNOR NF V08-106 (Определение количества E. coli в морепродуктах качественным методом, используя метод прямого импеданса).
Метод валидирован как альтернативный метод анализа в соответствии с ISO 16140:2003 Институтом стандартизации AFNOR, Франция.
Приборы "БакТрак 4300", "БакТрак 4100" и "БакТрак 4250", внесены в Реестр средств измерений как кондуктометрические анализаторы для микробиологических исследований.
Метод, основанный на измерении импеданса, приборы "БакТрак 4300", "БакТрак 4100" и "БакТрак 4250", внесены в Национальные стандарты ряда европейских стран: Германии - DIN 10115, 10120, 10121, Австрии - ONORM 10115, 10120, 10121, Франции - AFNOR NF V08-105 (Микробиология продуктов питания и кормов: указания по импедансному методу для микробиологических исследований), AFNOR NF V08-106 (Определение количества E. coli в морепродуктах качественным методом, используя метод прямого импеданса).
Метод валидирован как альтернативный метод анализа в соответствии с ISO 16140:2003 Институтом стандартизации AFNOR, Франция.
Слайд 53Прибор "БакТрак" является автоматизированной экспресс-системой для ускоренной количественной и качественной оценки
степени микробной контаминации продовольственного сырья, пищевых продуктов, косметической и фармацевтической продукции, питьевой воды и других объектов внешней среды.
Слайд 54Приборы "БакТрак" серии 4000
на основе метода разделенного импеданса регистрируют 2 определенных
показателя импеданса для каждого измерения.
М-величина (импеданс среды)
Е-величина (импеданс электрода).
Измерения М-параметра представляет собой относительное изменение (уменьшение) импеданса среды, выраженное в процентах к начальному измерению.
М-параметр в основном отображает ту часть импеданса, которая связана с активной проводимостью. На него непосредственное влияние оказывает ионный состав среды при росте микроорганизмов, а также используемый для анализа образец. При высокой электропроводимости питательной среды данный параметр теряет значимость.
На величину Е-параметра состав питательной среды влияет уже не в столь сильной мере, что весьма важно в случаях, когда используются среды с высоким содержанием солей (т.е. в них добавлены соли в качестве селективных компонентов, используемых для обнаружения патогенных микроорганизмов).
М-величина (импеданс среды)
Е-величина (импеданс электрода).
Измерения М-параметра представляет собой относительное изменение (уменьшение) импеданса среды, выраженное в процентах к начальному измерению.
М-параметр в основном отображает ту часть импеданса, которая связана с активной проводимостью. На него непосредственное влияние оказывает ионный состав среды при росте микроорганизмов, а также используемый для анализа образец. При высокой электропроводимости питательной среды данный параметр теряет значимость.
На величину Е-параметра состав питательной среды влияет уже не в столь сильной мере, что весьма важно в случаях, когда используются среды с высоким содержанием солей (т.е. в них добавлены соли в качестве селективных компонентов, используемых для обнаружения патогенных микроорганизмов).
Слайд 57Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом
наиболее вероятного числа с применением автоматического
экспресс-анализатора ТЕМПО
Методические рекомендации
экспресс-анализатора ТЕМПО
Методические рекомендации
Слайд 58Общие положения
Автоматический анализатор ТЕМРО предназначен для:
- подсчета жизнеспособных аэробных мезофильных микроорганизмов
в продуктах питания и объектах окружающей среды за 40 – 48 часов (тест ТЕМПО TVC);
- подсчета общего числа колиформ (БГКП) в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24 часа (тест ТЕМПО ТС);
- подсчета колиформ в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24 часа (тест ТЕМПО СС);
- подсчета Escherichia coli в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24 часа (тест ТЕМПО ЕС);
- подсчета энтеробактерий в продуктах питания и объектах окружающей среды за 22-27 часов (тест ТЕМПО ЕВ);
- подсчета коагулазоположительных стафилококков в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24-27 часов без необходимости подтверждения результата (тест ТЕМПО STA);
- подсчета лактобактерий в продуктах питания и объектах окружающей среды за 40-48 часов (тест ТЕМПО LAB).
- подсчета общего числа колиформ (БГКП) в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24 часа (тест ТЕМПО ТС);
- подсчета колиформ в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24 часа (тест ТЕМПО СС);
- подсчета Escherichia coli в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24 часа (тест ТЕМПО ЕС);
- подсчета энтеробактерий в продуктах питания и объектах окружающей среды за 22-27 часов (тест ТЕМПО ЕВ);
- подсчета коагулазоположительных стафилококков в продуктах питания и объектах окружающей среды за 24-27 часов без необходимости подтверждения результата (тест ТЕМПО STA);
- подсчета лактобактерий в продуктах питания и объектах окружающей среды за 40-48 часов (тест ТЕМПО LAB).
Слайд 59Количественный учет микроорганизмов основан на методе наиболее вероятного числа, соединенном с
технологией карт ТЕМРО.
Метод определения наиболее вероятного числа основан на высеве продукта и (или) разведений навески продукта или смывной жидкости в жидкую питательную среду, инкубировании посевов, учете видимых признаков роста микроорганизмов, пересеве, при необходимости, культуральной жидкости на агаризованные среды для подтверждения роста микроорганизмов, подсчете их количества с помощью таблицы НВЧ (ИСО 7218-96 п. 9.4).
Метод определения наиболее вероятного числа основан на высеве продукта и (или) разведений навески продукта или смывной жидкости в жидкую питательную среду, инкубировании посевов, учете видимых признаков роста микроорганизмов, пересеве, при необходимости, культуральной жидкости на агаризованные среды для подтверждения роста микроорганизмов, подсчете их количества с помощью таблицы НВЧ (ИСО 7218-96 п. 9.4).
Общие положения
Слайд 60Автоматический анализатор ТЕМРО состоит из двух блоков – станции пробоподготовки и
станции учета результатов.
Станция пробоподготовки служит для приготовления суспензии, создания связи между информацией об образце и среде и картой ТЕМПО в программе ТЕМПО Prer, заполнения и запаивания карт в вакуумной станции.
Карта содержит 48 ячеек (лунок) различного объема, 16 лунок объемом 0,00225 см3, 16 лунок объемом 0,0225 см3 и 16 лунок объемом 0,225 см3, что позволяет производить количественный учет на основе метода наиболее вероятного числа без приготовления последовательных разведений.
Лунки являются реакционными зонами, в которых происходит определение микробного роста. После заполнения карты ТЕМРО помещают в обычный термостат.
Станция пробоподготовки служит для приготовления суспензии, создания связи между информацией об образце и среде и картой ТЕМПО в программе ТЕМПО Prer, заполнения и запаивания карт в вакуумной станции.
Карта содержит 48 ячеек (лунок) различного объема, 16 лунок объемом 0,00225 см3, 16 лунок объемом 0,0225 см3 и 16 лунок объемом 0,225 см3, что позволяет производить количественный учет на основе метода наиболее вероятного числа без приготовления последовательных разведений.
Лунки являются реакционными зонами, в которых происходит определение микробного роста. После заполнения карты ТЕМРО помещают в обычный термостат.
Сущность методики
Слайд 61Определение общего микробного числа
Определение основано на способности микроорганизмов продуцировать внеклеточные
ферменты.
В состав питательной среды входит специфический субстрат, меченый 4-метил умбеллифероном.
Во время роста микроорганизмы выделяют в культуральную жидкость ферменты, которые расщепляют субстрат, в результате чего освобождается свободный 4-метил умбеллиферон, обладающий флуоресцентной способностью.
В состав питательной среды входит специфический субстрат, меченый 4-метил умбеллифероном.
Во время роста микроорганизмы выделяют в культуральную жидкость ферменты, которые расщепляют субстрат, в результате чего освобождается свободный 4-метил умбеллиферон, обладающий флуоресцентной способностью.
Слайд 62Определение количества E. Coli
Определение основано на способности 96% штаммов E.
Coli продуцировать фермент β-глюкуронидазу.
В состав питательной среды ТЕМРО ЕС входит специфический субстат –4-метил умбеллиферил-β-D-глюкуронид.
Во время роста микроорганизмы выделяют в культуральную жидкость β-глюкуронидазу, которая расщепляет субстрат. При этом в питательную среду выделяется свободный 4-метилумбеллиферон, обладающий флуоресцентной способностью.
В состав питательной среды ТЕМРО ЕС входит специфический субстат –4-метил умбеллиферил-β-D-глюкуронид.
Во время роста микроорганизмы выделяют в культуральную жидкость β-глюкуронидазу, которая расщепляет субстрат. При этом в питательную среду выделяется свободный 4-метилумбеллиферон, обладающий флуоресцентной способностью.
Слайд 63Количество продуктов реакции прямо пропорционально численности популяции микроорганизмов.
Наличие флуоресцентнго сигнала
считывается и фиксируется в автоматическом режиме ридером ТЕМРО Reader.
В зависимости от количества и объема положительных лунок, а так же разведения производится подсчет общего числа микроорганизмов в исходном образце методом наиболее вероятного числа в автоматическом режиме.
В зависимости от количества и объема положительных лунок, а так же разведения производится подсчет общего числа микроорганизмов в исходном образце методом наиболее вероятного числа в автоматическом режиме.
Слайд 64Определение количества бактерий семейства Enterobacteriaceae и колиформ
Определение основано на способности
микроорганизмов менять рН среды во время культивирования.
Снижение значения рН среды в процессе культивирования обусловлено углеводным метаболизмом.
В питательную среду добавлен 4-метил умбеллиферон, обладающий флуоресцентной способностью только при значениях рН ≥ 6.
В качестве дополнительного источника углеводов в питательную среду для определения бактерий семейства Enterobacteriaceae добавлена глюкоза, для определения количества колиформ – лактоза.
Снижение значения рН среды в процессе культивирования обусловлено углеводным метаболизмом.
В питательную среду добавлен 4-метил умбеллиферон, обладающий флуоресцентной способностью только при значениях рН ≥ 6.
В качестве дополнительного источника углеводов в питательную среду для определения бактерий семейства Enterobacteriaceae добавлена глюкоза, для определения количества колиформ – лактоза.
Слайд 65В процессе роста бактерии усваивают углеводы, что приводит к снижению уровняя
рН среды прямо пропорционально численности популяции исследуемых микроорганизмов.
Когда рН среды достигает значений ≤ 6, 4-метил умбеллиферон теряет способность к флуоресценции.
Отсутствие флуоресцентнго сигнала считывается и фиксируется в автоматическом режиме ТЕМРО Reader.
В зависимости от количества и объема положительных лунок, а так же разведения производится подсчет общего числа микроорганизмов в исходном образце методом наиболее вероятного числа в автоматическом режиме.
Когда рН среды достигает значений ≤ 6, 4-метил умбеллиферон теряет способность к флуоресценции.
Отсутствие флуоресцентнго сигнала считывается и фиксируется в автоматическом режиме ТЕМРО Reader.
В зависимости от количества и объема положительных лунок, а так же разведения производится подсчет общего числа микроорганизмов в исходном образце методом наиболее вероятного числа в автоматическом режиме.
Слайд 66Проведение испытания
Определение количества аэробных мезофильных микроорганизмов в продуктах питания.
Определение общего
числа колиформ (БГКП) в продуктах питания
Подсчет колиформ в продуктах питания
Подсчет Eshcerichia coli в продуктах питания
Подсчет энтеробактерий в продуктах питания
Подсчет Staphyllococcus aureus в продуктах питания.
Подсчет лактобактерий в продуктах питания.
Определение микробного загрязнения объектов окружающей среды обитания методом смывов
Подсчет колиформ в продуктах питания
Подсчет Eshcerichia coli в продуктах питания
Подсчет энтеробактерий в продуктах питания
Подсчет Staphyllococcus aureus в продуктах питания.
Подсчет лактобактерий в продуктах питания.
Определение микробного загрязнения объектов окружающей среды обитания методом смывов
Слайд 67Обработка результатов
После считывания карт, полученные результаты анализируются программным обеспечением.
На
основе количества положительных лунок, их объема, степени разведения программа рассчитывает результат в КОЕ/г или КОЕ/см3 исходного образца или смыва методом наиболее вероятного числа.
При исследовании объектов окружающей среды методом смывов количество микроорганизмов на 1 см2 исследуемого образца вычисляют по формуле:
М=(М1 х V)/S,
Где: М – количество микроорганизмов на 1 см2, КОЕ/ см2;
М1 – количество микроорганизмов в 1 мл смывной жидкости, КОЕ/ см3;
V – объем смывной жидкости, внесенной в питательную среду, см3;
S – площадь исследованной поверхности, см2.
При исследовании объектов окружающей среды методом смывов количество микроорганизмов на 1 см2 исследуемого образца вычисляют по формуле:
М=(М1 х V)/S,
Где: М – количество микроорганизмов на 1 см2, КОЕ/ см2;
М1 – количество микроорганизмов в 1 мл смывной жидкости, КОЕ/ см3;
V – объем смывной жидкости, внесенной в питательную среду, см3;
S – площадь исследованной поверхности, см2.
Слайд 68Ограничение метода
Неправильное заполнение карты (пустые лунки и/или остатки суспензии во
флаконе после заполнения), а также нарушение правил забора и хранения образцов может привести к получению ложных результатов.
Принимая во внимание то, что флуоресцентный сигнал может изменяться при интенсивной окраске исходного раствора, необходимо разведение таких образцов не менее 1/400.
Не рекомендуется использовать наборы ТЕМРО для испытаний продуктов, обладающих высокой ферментативной активностью.
Принимая во внимание то, что флуоресцентный сигнал может изменяться при интенсивной окраске исходного раствора, необходимо разведение таких образцов не менее 1/400.
Не рекомендуется использовать наборы ТЕМРО для испытаний продуктов, обладающих высокой ферментативной активностью.
