Репликация и экспрессии геномов ДНК-вирусов бактерий и эукариот презентация

Содержание

Роджер и Артур Корнберги

Слайд 1
Репликация и экспрессии геномов ДНК-вирусов бактерий и эукариот

Слайд 2

Слайд 4Роджер и Артур Корнберги

Слайд 5ДНК-вирусы растений. Каулимовирусы.

Слайд 10Каулимовирусы (Caulimoviruses)

Слайд 14ДНК-вирусы растений. Геминивирусы.

Слайд 15Bean golden mosaic virus genus

Слайд 19Banana bunchy top virus

Слайд 20Faba bean necrotic yellows virus

Слайд 23
Репликация и экспрессии геномов ДНК-вирусов бактерий и эукариот

Слайд 25Роджер и Артур Корнберги

Слайд 27Бактериофаги

Слайд 28РНК-содержащие бактериофаги

Слайд 29
Механизмы синтеза РНК довольно консервативны и однообразны среди вирусов. Однако, большое

разнообразие наблюдается в механизмах регуляции процесса транскрипции.
Для чего нужна регуляция транскрипции геномной ДНК?
1. на разных стадиях цикла репродукции требуются разные белки.
2. белки нужны в разных количествах (требуется много структурных белков и меньше энзимов).
3. избыток ранних белков может подавлять активность белков поздних стадий.
 
Уровни регуляции экспрессии генов:
1. транскрипционный
2. посттранскрипционный (чаще трансляционный)

Слайд 30
Принципы регуляции транскрипции:
1. Системность. Один механизм регуляции транскрипции может контролировать экспрессию

группы генов.
2. Каскадность. Включение экспрессии одних генов может быть связано с репрессией или активацией других генов.
   Белки вирусов условно делят на:
1. ранние (истинно ранние).
2. средние (отсроченно ранние).
3. поздние.


Слайд 31

Как правило, регулируемыми стадиями транскрипции являются инициация и терминация. В

принципе, в некоторых системах может регулироваться и элонгация транскрипции.
   
Выход продукта экспрессии гена зависит от:
1. частоты инициации транскрипции
2. длины гена (положение терминатра)


Слайд 32
Можно различить несколько уровней сложности систем транскрипции фаговых геномов в зависимости

от степени модификации транскрипционного аппарата бактерии-хозяина.
В наиболее простых системах, когда комбинацией промоторов и терминаторов различной силы регулируется количество синтезируемой мРНК, используются лишь белки аппарата транскрипции хозяина.
Другие вирусы кодируют регуляторные белки активации и репрессии транскрипции, третьи модифицируют отдельные субъединицы хозяйской РНК-полимеразы.
И наконец, существуют варианты полного замещения хозяйского аппарата транскрипции на фагоспецифический.

Слайд 33Бактериальная ДНК-зависимая РНК-полимераза включает “коровую“ часть, включающую две α субъединицы, β- и

β’-субъединицы, а также ω-субъединицу.

Слайд 34
Частота инициации зависит от силы промотора. Чем сильнее промотор, тем выше

сродство к нему полимеразы, а, значит, выше частота инициации транскрипции.
За узнавание промотора и определение стартовой точки транскрипции у прокариот отвечает σ-субъединица РНК-полимеразы. Основной тип σ-субъединиц – это σ70, отвечающая за транскрипцию большинства генов бактерий. Другие σ-факторы используются лишь при специфических условиях роста или при стрессе.

Слайд 35В комплексе с другими субъединицами σ-фактор, включающий 613 аминокислотных остатков имеет

не глобулярную, а вытянутую форму.

Слайд 36Домены, расположенные на дистальных концах σ-субъединицы, узнают два элемента промотора. Стандартный

промотор РНК-полимеразы включает в себя элементы находящиеся вблизи положений –10 (консенсус 5’-TATAAT-3’, узнаваемый центральным доменом 2.4) и –35 (консенсус 5’-TTGACA-3’, узнаваемый С-концевым доменом 4.2 длиной 88 аминокислот) от старта транскрипции

Слайд 37
Сродство промотора и σ-субъединицы зависит прежде всего от оптимального расстояния между

консенсусными элементами и их первичной структуры.
Целый ряд σ70-зависимых промоторов обладают далеко не оптимальной для узнавания структурой –35 элемента и, тем не менее, весьма активно узнаются РНК-полимеразой. Такие промоторы содержат удлиненный –10 консенсус типа 5’-TGNTATAAT-3’.
Известно, что в некоторых случаях CTD-домен α-субъединиц узнает последовательности в области от -40 до –60 (UP элементы), что может резко увеличивать силу промотора.

Слайд 38 РНК-полимераза связывает промотор поэтапно. Сначала формируется достаточно слабый так называемый

«закрытый» комплекс, который спонтанно изомеризуется с образованием «открытого» комплекса. В «открытом» комплексе примерно 10 нуклеотидных пар в области старта транскрипции переходят в одноцепочечную форму. Формирование «открытого» комплекса у большинства промоторов необратимо ведет (при наличии рибонуклеозидтрифосфатов) к началу процесса транскрипции.

Слайд 39
Терминация транскрипции.
У прокариот имеется два механизма регуляции терминации транскрипции. Это ρ

(Rho)-зависимая терминация и ρ-независимая терминация.
ρ-фактор представляет собой олигомерный белок (гексамер) функционирующий как РНК-ДНК хеликаза (3'-5'), которая в АТФ-зависимой реакции расплетает гетеродуплекс РНК-ДНК.
В ρ-независимой терминации участвуют специальные сигналы РНК, задерживающие работу РНК-полимеразы. Чаще всего сигналами ρ-независимой терминации являются GC-богатые шпилечные участки мРНК, за которыми следует U-богатая область.
В результате возможны остановки полимеразы. В момент паузы возможен стохастический выбор между терминацией синтеза и продолжением процесса транскрипции. Это создает возможность снижения в той или иной степени эффективности транскрипции отдельных генов и оперонов в зависимости от встречаемости сегментов ДНК, способствующих паузам.

Слайд 41
Итак, комбинацией промоторов и терминаторов различной силы можно регулировать количество синтезируемой

мРНК, а, значит, и количество белка.
Примером простой системы, в которой отсутствует временная, но есть количественная регуляция транскрипции, являются фаги с кольцевой одноцепочечной ДНК.

Слайд 42Бактериофаги

Слайд 44В геноме фагов есть две транскрипционные единицы. Одна из транскрипционных единиц

содержит белки, нужные в достаточно больших количествах. В транскрипционной единице несколько сильных промоторов. Белки II и V участвуют в процессе репликации и упаковки генома, а за ними следуют гены структурных белков, главный из которых VIII. Вероятность образования транскриптов, кодирующих белок VIII, выше, чем мРНК гена II. Соответственно, белка VIII будет намного больше, чем белка II. Вторая транскрипционная единица начинается за первой и кодирует белки нужные в малых количествах. В этой транскрипционной единице имеются слабые промоторы (А-промоторы). Сильный промотор Ps находится за терминатором первой транскрипционной единицы. Перед геном I вообще отсутствует промотор и его транскрипция возможна лишь в том случае если преодолевается ρ-зависимый терминатор. Очевидно, что вероятность этого события мала, поэтому образуется очень малое количество его мРНК и, соответственно, белка I. За счет наличия нескольких терминаторов образуется группа мРНК, кодирующих белок IV.

Слайд 45
Такой принцип количественной транскрипционной регуляции называется каскадным (не путать с темпоральной

каскадной регуляцией).

Возможно, еще более яркий пример сочетания принципа каскадности на уровнях инициации и терминации транскрипции представляет фаг φХ174.

Слайд 47
Итак, фаг φХ174 дает нам прекрасный пример позитивной каскадной количественной регуляции,

когда экспрессия гена возрастает, если он расположен в конце транскрипционной единицы и “обслуживается” сразу несколькими промоторами.
С другой стороны, столь же отчетливо наблюдается негативная каскадная регуляция в случае, если ген отделен от промоторов одним или несколькими терминаторами транскрипции.

Слайд 48Регуляция экспрессии генов фага λ
Фаг λ - Умеренный бактериофаг
48,502 bp


Система регуляции транскрипции фага лямбда несравненно сложнее, чем у фагов М13 и φХ174.

Слайд 49Жизненный цикл литических фагов

Слайд 50Явление лизогении

Слайд 51Индукция профага

Слайд 52Устройство генома лямбдоидных фагов

Слайд 53БАКТЕРИОФАГ ЛЯМБДА

Слайд 54На ранней стадии происходит активация транскрипции с помощью клеточных белков. Белок

DnaA, участвующий в инициации репликации бактериальной ДНК, может сильно стимулировать работу промотора PR. Он кооперативно связывается с двумя участками ДНК (DnaA box), расположенными уже после стартовой точки транскрипции на расстоянии 20 и 200 пар нуклеотидов. Такой тип связывания транскрипционных активаторов более характерен для эукариотических систем. Активация промотора вызывается взаимодействием DnaA с β-субъединицей РНК-полимеразы, и это взаимодействие влияет не только на образование “закрытого“, но и “открытого“ комплексов, что очень эффективно усиливает транскрипцию. Учитывая, что DnaA активирует целый ряд бактериальных промоторов (polA, glpD и nrd) можно говорить о потенциальном участии в узнавании промотора почти всех субъединиц РНК-полимеразы.

Слайд 55С промотора PL происходит транскрипция гена N. Белок N – это

полипептид массой 12 кДа, выполняющий функцию антитерминатора ρ-зависимой терминации, но может также действовать и на некоторые ρ-независимые терминаторы. Интересно, что мутацию по N гену супрессируется рядом мутантов по ρ-фактору. Помимо N белка для антитерминации необходимо наличие на мРНК мотивов nut (N - utilization), привлекающих белок N. Эти мотивы обнаруживаются перед геном N (после PL) и в 3’-конце гена cro, и называются соответственно nutL и nutR.

Слайд 56Мотивы nut состоят из последовательности box A длиной 8 н.т., спейсера

длиной 9-10 н.т. и boxB, формирующего несовершенную шпильку и ответственного за связывание белок N. После того, как белок N взаимодействует с boxB происходит изменение его конформации. Далее с ним взаимодействуют клеточные белки NusA и NusG, а также ДНК-зависимая РНК-полимераза. В то же время с box A связываются NusB и NusE белки. Этот комплекс образуется только тогда, когда синтезируется соответствующая последовательность мРНК. В комплексе устанавливаются множественные взаимодействия. Когда полный комплекс образуется, он обеспечивает стабильное взаимодействие N-белка с элонгирующей РНК-полимеразой. В итоге полимераза становится нечувствительной к ρ-фактору.








nut | N | NusA | NusG | S 10 | RP
   
 
 
 
 

Слайд 58Важнейшая роль на стадии выбора пути инфекции принадлежит белку CII. Основные

способы регуляции процесса связаны с тем, что CII белок весьма нестабилен. Это определяется системой Hfl, ответственной за быструю деградацию белка в клетке. Повреждение системы Hfl (High Frequency of Lisogenisation) стимулирует переход фага в лизогенное состояние. Эта система содержит АТФ-зависимую мембраносвязанную протеазу FtsH (ген hflB), разрушающую СII. Другие компоненты системы (hflK, hflC и hflD) являются мембраносвязанными белками активирующими FtsH и привлекающими СII к клеточной мембране.

Слайд 59В клетке активность системы Hfl регулируется системой катаболитной репрессии, включающей сAMP

и CRP (сAMP-responsive protein). Эта система угнетает активность Hfl. Свое действие система осуществляет на уровне регуляции транскрипции: CRP ингибирует транскрипцию генов компонентов системы Hfl и может непосредственно ингибировать активность протеаз. Таким образом, внешние сигналы могут регулировать содержание СII, который при достижении определенной критической концентрации запускает целый каскад механизмов, обеспечивающих установление лизогении. Например, выращивание зараженных бактерий на богатой среде приводит систему Hfl в высокоактивное состояние, а значит препятствует установлению лизогении.

Слайд 60Белок CII длиной 97 аминокислот действует как транскрипционный фактор, открывающий новые

промоторы. CII узнает последовательности ДНК типа TTGCN6TTGC, но не каждый такой элемент становится промотором. Необходимо, чтобы район N6 занимал положение, соответствующее –35 консенсусу, а рядом находился элемент – 10. Белок CII, по-видимому, взаимодействует с σ-субъединицей РНК-полимеразы, привлекая ее к на промотор вместо -35 элемента. Выделяют 3 левонаправленных промотора, индуцируемых белком CII. Это промоторы Pi, PRE и Paq

Слайд 62Белок CII длиной 97 аминокислот действует как транскрипционный фактор, открывающий новые

промоторы. CII узнает последовательности ДНК типа TTGCN6TTGC, но не каждый такой элемент становится промотором. Необходимо, чтобы район N6 занимал положение, соответствующее –35 консенсусу, а рядом находился элемент – 10. Белок CII, по-видимому, взаимодействует с σ-субъединицей РНК-полимеразы, привлекая ее к на промотор вместо -35 элемента. Выделяют 3 левонаправленных промотора, индуцируемых белком CII. Это промоторы Pi, PRE и Paq

Слайд 63БАКТЕРИОФАГ ЛЯМБДА

Слайд 64Нужны внешние воздействия для выхода фага из лизогенного состояния. Таким событием,

например, может быть повреждение ДНК вследствие действия ультрафиолетового излучения. Это активирует SOS-систему репарации ДНК, включая белки RecA и Lon протеиназу. Результатом является образование комплекса копротеазы RecA с бактериальным репрессором генов системы репарации LexA и с репрессором фага лямбда, приводящее к расщеплению молекул репрессоров на две части. Механизм расщепления репрессоров не полностью ясен. Так рассматривается схема автокаталитического расщепления репрессоров после взаимодействия с RecA. После разрушения комплексов репрессора с ДНК фага происходит активация транскрипции с правонаправленного и левонаправленного промоторов. При этом активация правонаправленного промотора приводит к усиленной транскрипции гена cro.

Слайд 65БАКТЕРИОФАГ ЛЯМБДА

Слайд 66Белок cro длиной 66 остатков, содержит только один домен и узнает

те же операторные участки, что и CI. Однако, его аффинность к операторной области иная. Наибольшим сродством он обладает к третьему операторному участку и быстро блокирует транскрипцию с промотора PRM. Связывание димеров cro с ДНК является малокооперативным. Видимо, предпочтительное связывание cro с ОR3 полностью репрессирует PRM и в подходящих условиях необратимо переключает путь развития фага на литический. Уровень транскрипции с PR также зависит от концентрации cro. При увеличении концентрации он начинает взаимодействовать и со вторым операторным участком, тем самым, подавляя работу промотора PR и ограничивая транскрипцию собственного гена. При действии cro репрессора происходит регуляция транскрипции и с левого промотора (PL).

Слайд 67Белок Q, как и N, является антитерминатором транскрипции и абсолютно необходим

для литического пути развития. Он также требует специальный цис-элемент – qut (Q utilisation). Справа от гена Q находится сильный промотор PR’, но из-за сильного ρ-независимого терминатора при его работе образуются лишь короткие нефункциональные мРНК. В отличие от N белок Q действует на уровне образования комплекса ДНК-белок. Известно, что действие белка Q процессивно: РНК-полимераза, двигаясь вправо, остается связанной с комплексом qut-Q. В результате взаимодействия с белком Q полимераза меняет свою конформацию, что помогает ей дальше легко преодолевать терминаторы. С промотора PR’ транскрибируются гены лизиса S и R, а также гены структурных белков вириона фага.

Слайд 68БАКТЕРИОФАГ ЛЯМБДА

Слайд 69Сборка головки фага

Слайд 70Сборка хвостового отростка

Слайд 71БАКТЕРИОФАГ Т4

Слайд 72
Гены Т4 делятся на истинно ранние, ранние, средние и поздние. Около

40 промоторов ранних генов узнаются немодифицированной клеточной РНК-полимеразой. Однако, для успешной конкуренции с бактериальными промоторами фаг использует два регуляторных механизма. Во-первых, ранние промоторы содержат похожие на бактериальные -35 и -10 элементы. Однако, окружение этих элементов отличается от бактериальных промоторов, что обеспечивает большее их сродство к РНК-полимеразе и, как следствие, предпочтительную экспрессию фаговых генов. Во-вторых, совместно с инъекцией фаговой ДНК в клетку попадает также вирусный белок Alt (мол. масса около 70 кДа). Он обладает активностью АДФ-рибозилтрансферазы и на самых ранних этапах инфекции модифицирует одну из α-субъединиц РНК-полимеразы, а также, с несколько меньшей эффективностью, субъединицы β, β’ и σ. В результате резко усиливается транскрипция ранних вирусных промоторов по сравнению с клеточными.

Слайд 73
Среди продуктов истинно ранних генов фага обнаруживаются еще две АДФ-рибозил-трансферазы. Соответствующие

гены называются ModA (23 кДа) и ModB (24 кДа). Ферменты способны модифицировать все субъединицы α хозяйской РНК-полимеразы. Модификация приводит к ослаблению связи σ-субъединицы с другими субъединицами РНК-полимеразы и ухудшает ее способность узнавать также и клеточные промоторы, содержащие UP элементы.

Слайд 74
Для транскрипции средних генов нужны вирусные белки Asi A (antisigma) и

Mot (Modification of transcription). Asi A – маленький белок (длиной 90 а.к.), взаимодействующий с σ70-субъединицей. В этом комплексе σ-субъединица плохо узнает элементы -35. В результате не узнаются промоторы ранних генов фага и клеточные промоторы. Однако, полное ингибирование ранних промоторов наблюдается лишь при модификации обеих α-субъединиц РНК-полимеразы с помощью Mod. На этапах инфекционного цикла, когда модифицирована только одна из α-субъединиц, Asi A способствует, как ко-активатор, вместе с белком Mot, селективной инициации на средних промоторах. Mot нужен для включения средних генов. Их промоторы имеют в -30 положении участок для узнавания белка Mot – MotA box (5’-atTGCTTtA-3’). Другим доменом Mot взаимодействует с σ-субъединицей РНК-полимеразы. Таким образом, белок Mot по своей функции напоминает белок CII фага λ.

Слайд 76
Промоторы поздних генов содержат элементы, существенно отличающие их от клеточных промоторов.

Для их транскрипции нужны следующие вирусспецифические белки: gp55, который полностью замещает σ-субъединицу в РНК-полимеразе (важно, что σ-субъединица слабо связана с другими субъедницами РНК-полимеразы из-за АДФ-рибозилирования и взаимодействия с AsiA) и белок gp33, являющийся коактиватором и способствующий взаимодействию с gp45 (фактор процессивности ДНК-полимеразы). В этом случае важно, что транскрипция поздних генов начинается в ходе репликации ДНК. И для того, чтобы произошла транскрипция позднего гена нужно, чтобы в районе его промотора прошел gp45. При этом меняется конформация этого участка, т.е. происходит расплетание ДНК, а gp45 действует как подвижный энхансер.

Слайд 77
Известно, что gp55 является фактором, обеспечивающим весьма слабое сродство к ДНК

по сравнению с σ70-субъединицей и другими подобными факторами РНК-полимеразы. В результате, фаг Т4 кодирует 3 дополнительных белка, участвующие в регуляции транскрипции на стадии инигибирования взаимодействия РНК-полимеразы с хозяйскими факторами σ38 и σ32 на стадиях цикла до полного расщепления клеточной ДНК.

Слайд 78
Alt
(ModA, ModB)
АДФ-рибозилтрансферазы
для α-субъединиц РНК-полимеразы
Asi A (antisigma), Mot
Mod

- АДФ-рибозилтрансфераза

Слайд 79БАКТЕРИОФАГ Т7

Слайд 80Все гены фага Т7 транскрибируются с одной и той же цепи

ДНК слева направо. Ген 0.3 транскрибируется первым в левой части генома, а ген 19.5 последним в правой части. Геном фага кодирует собственную РНК-полимеразу (ген 1). Эта полимераза состоит из одной субъединицы и работает намного быстрее клеточной. Она нужна для транскрипции около 80% ДНК в правой части генома. Различают 3 класса генов у фага Т7. Класс I экспрессируется со 2ой по 8ую минуту после инфицирования бактерий с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы; класс II – между 6ой и 15ой мин. с помощью вирусной РНК-полимеразы и класс III – c 8ой по 25ую мин. также с помощью вирусной РНК-полимеразы

Слайд 81Первоначально в клетку бактерии попадает левый конец генома размером около 850

пар оснований. Этот район включает промотор (φOL), узнаваемый только фагоспецифичной РНК-полимеразой и возможно способствующий репликации вирусной ДНК, и 4 промотора (EcA0, EcA1, EcA2, ECA3) для полимеразы E.coli, из которых 3 последних являются очень сильными. После попадания фага в клетку, клеточная РНК-полимераза транскрибирует самый левый конец генома (19% ДНК, включающих гены класса I) вплоть до сильного Rho-независимого терминатора, ТЕ (Рис. ХХ). При этом производится не только мРНК, но и энергия для втягивания в клетку около 1/5 части генома слева. Скорость проникновения ДНК фага в клетку на этой стадии равна примерно 50 нп/сек, т.е. равна скорости движения бактериальной РНК-полимеразы по матрице ДНК.

Слайд 82
Ранние транскрипты у фага Т7 подвергаются процессингу РНКазой III. Точек разрезания

в ранней области генома имеется 5, однако, только мРНК гена 1 является моноцистронной. Хотя экспрессия ранних генов у фага Т7 резко снижается после 8 минут инфекции, соответствующие мРНК, процессированные РНКазой III, обнаруживаются и на поздних этапах инфекции. Очевидно, существует пока неизвестный механизм трансляционного выключения экспрессии ранних фаговых белков.

Слайд 83 Важнейшую роль в инфекционном цикле фага играет ген 0.3, который

экспрессируется в ходе инфекции первым. Его продукт связывает и инактивирует рестрикционные ферменты типа I. Только полярное внедрение ДНК в бактерию из вириона может обеспечить продуктивную инфекцию. В опытах по альтернативному введению генома Т7 в бактерии во всех случаях происходила быстрая деградация фаговой ДНК.

Среди ранних продуктов экспрессии появляется и РНК–полимераза фага, которая первоначально инициирует транскрипцию на 10 специфических промоторах, расположенных перед генами класса II. К этому классу относится и ген 2, кодирующий ингибитор клеточной РНК-полимеразы, который образует с ней прочный комплекс. Терминация транскрипции фаговой полимеразой происходит специфично на терминаторе, расположенном в районе поздних генов, и неспецифично при достижении правого конца генома

Слайд 84Пять фагоспецифических промоторов для генов класса III являются гораздо более сильными,

чем промоторы класса II. На этом основан принцип темпоральной каскадной регуляции транскрипции у фага Т7. Продукт гена 3.5 (фаговый лизоцим), связываясь с Т7 полимеразой резко увеличивает вероятность образования абортивных инициаторных комплексов, не переходящих к стадии элонгации и, таким образом, блокирующих повторные циклы инициации. Это затрагивает в первую очередь промоторы генов класса II, но гораздо менее влияет на гены класса III, чьи промоторы имеют чрезвычайно высокое сродство к молекулам Т7 полимеразы, что способствует быстрому вытеснению абортивных инициаторных комплексов. Транскрипция фаговой полимеразой является, также как и ранняя транскрипция, движущим механизмом для проникновения ДНК вируса в клетку. Однако на этой стадии процесс происходит гораздо быстрее – со скоростью около 250 нп/сек, и весь процесс занимает менее 10 мин.

Слайд 85Регуляция транскрипции у фага N4   Геном этого фага представлен линейной двуцепочечной ДНК

длиной 72 000 п.н. Гены делятся условно на ранние, поздние и средние. Этот вирус интересен тем, что хозяйская РНК-полимераза используется не на ранних этапах инфекции, как у подавляющего большинства фагов, кодирующих собственную систему транскрипции, а на поздних.

Ранние гены транскрибируются фаговой РНК-полимеразой длиной 3500 аминокислот, которая находится в вирионе в количестве 1-2 копий и вносится в клетку при инфекции. Этот фермент эволюционно отдаленно близок Т7 РНК-полимеразе. Вирионная РНК-полимераза не способна узнавать промоторы на двуцепочечной ДНК, и использует только сверхспирализованную ДНК вируса, образовавшуюся при действии ДНК-гиразы E.coli. Ранние промоторы фага представляют собой консервативные шпилечные структуры, включающие концевую петлю длиной 3 остатка и двуспиральный стебель длиной 5-7 пар оснований. Такие шпильки стабилизируются ssb-белком E.coli, связывающим прилежащие односпиральные участки.

Слайд 88
Средние гены транскрибируются N4 РНК-полимеразой II, являющейся продуктом ранних генов и

состоящей из двух белков gр15 (30 кДа) и gр16 (40 кДа). Важнейшую роль играет также ДНК-связывающий белок gp2. Подобно вирионной РНК-полимеразе РНК-полимераза II узнает только одноцепочечные промоторные районы. Белок gр2, связывая преимущественно одноцепочечные участки, стабилизирует структуру промоторных районов и непосредственно участвует в узнавании промоторов, взаимодействуя с самим ферментом.

Слайд 90
Поздние гены транскрибируются клеточной σ70-содержащей РНК-полимеразой. Однако, поздние промоторы N4 проявляют

весьма слабую гомологию консенсусам –10 и –35. Соответственно, in vitro ДНК фага является очень слабой матрицей для хозяйской РНК-полимеразы. Оказалось, что фаговый ДНК-связывающий белок (N4SSB), участвующий в репликации и рекомбинации, является активатором поздней транскрипции. С его помощью стабилизируются специфические шпилечные структуры в области поздних промоторов.

Слайд 93ДНК полимераза III E.coli
Фермент состоит из нескольких субъединиц и представляет собой

гетероолигомер. Состоит из трех групп белков.
1) каталитический “соre” включает каталитические субъединицы α2 (синтез ДНК) и ε2 (экзонуклеазная 3’-5’активность);

2) β2-фактор процессивности полимеразы (аналог PCNA);
3) τ2, γ2,δ2,δ’2, χ, ψ – clamp loader (загружает фактор процессивности на ДНК с затратой АТФ). τ в нужный момент способствует посадке кольца β-субъединицы.
Наоборот, δ,γ,δ’ как «гаечный ключ» раскрывает β2-фактор.
Фактор процессивности снимается с ДНК, когда полимераза сталкивается с затравкой. Затравку затем удаляют РНКазаН и ДНК полимераза I, которая обладает 5’-3’ экзонуклеазной активностью и способна съедать последний рибонуклеотид затравки, связанный с дезоксирибонуклеотидом.

Слайд 95Enterobacteria phage P2 33.5 Kbp

Слайд 96Репликация ДНК бактериофага λ
Инициация репликации. Участок инициации репликации Ori первоначально узнается

вирусным белком – О-белком (продукт гена О). О-белок тетрамеризуется на ori и образует комплекс с ДНК, называемый О-сомой. Этот комплекс можно наблюдать и в электронном микроскопе.

Слайд 97 Если ассоциация белка О с комплексом DnaB-Р-белок не произойдет (в случае

недостатка DnaB в клетке или посадке О белка на неспецифические участки ДНК фага) происходит разворачивание О-сомы за счет транскрипции этого участка ДНК и быстрая деградация белка О протеазным комплексом ClpP/ClpX. В случае формирования полной препраймосомы РНК-полимераза не способна разрушить комплекс О-белка с ДНК, однако, необходима дальнейшая модификация препраймосомы, т.к. в ее составе DnaB неактивен. В активации DnaB хеликазы участвуют клеточные белки – шапероны: DnaJ, GrpE, DnaK, которые вызывают диссоциацию белка Р из комплекса в ходе АТФ-зависимой реакции. После того, как DnaB начинает расплетать ДНК, на одноцепочечные участки ДНК садится праймаза DnaG и синтезирует РНК-затравки.

Слайд 99В ходе двунаправленной репликации по схеме Кернса в клетках, зараженных фагом

λ образуются около 50 молекул дочерних кольцевых ДНК, некоторые из которых уже через 15 минут после начала инфекции могут переходить к репликации по типу разматывающегося рулона. Это приводит к формированию конкатемерных ДНК молекул, содержащих около 10 эквивалентов вирусного генома.

Превращение схемы Кернса в схему разматывающегося рулона, возможно, связано с ослаблением траскрипции в участке ori с промотера P® и, как следствие, возникновением односторонней репликации. Причиной ослабления транскрипции c этого промотера может быть действие возрастающих количеств cro-репрессора. Кроме того, присутствие в клетке ограниченного количества белка DnaA, приводит к тому, что при увеличении числа копий фаговой ДНК, он вытитровывается, и транскрипция с промотера P® ослабляется. Действительно, показано, что в клетках бактерий, продуцирующих температурочувствительный мутант DnaA при 43 градусах, даже на очень ранних этапах инфекции репликация ДНК фага происходит почти исключительно по схеме разматывающегося рулона.

Слайд 100Созревание ДНК-конкатемеров
В итоге поздней репликации образуются конкатемерные молекулы, которые надо разрезать

на мономеры так, чтобы образовались липкие концы длиной 12 нуклеотидов. Нарезание осуществляется вирусной терминазой и сопряжено с упаковкой ДНК в вирусные частицы. Терминаза состоит из трех субъединиц белка А и включает также белок Nu1. Эти белки кодируются двумя генами, расположенными в крайней левой части генома (исходя из вирионной ДНК). Разрезание происходит по специфическим участкам геномной ДНК – cos. Последовательность, необходимая для разрезания по сайту cos включает около 100 пар оснований, что существенно больше, чем сайт разрезания (12 пар оснований).
 
 
 
 




Структура cos.
 
 


Белок А в виде димера присоединяется к CosB и вносит разрыв в CosN. С этого участка начинается упаковка ДНК. CosQ нужен для правильного процессирования противоположного конца ДНК, чтобы упаковывался только один эквивалент генома. Для действия терминазы необходимо также взаимодействие с cos районом (участки I1 и I2) клеточного фактора IHF, который сильно изгибает ДНК, а также вирусного белка Nu1 (узнает R1 , R2 и R3). Возможно, что процесс упаковки регулируется также путем взаимодействия белков капсида с терминазой.

Слайд 101Bacillus subtilis bacteriophage Φ29 21.1 Kbp

Слайд 104T7 phage

Слайд 108T7 phage

Слайд 113T4 bacteriophage

Похожие презентации

Экологическая игра. Знатоки родной природы 327
Бактерии и вирусы 357
Внутреннее строение млекопитающих 304
Корень. Корневые системы высших растений 478
Бег и сердце 251
Новые технологии: возможности и опасности 331

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое ThePresentation.ru?

Это сайт презентаций, докладов, проектов, шаблонов в формате PowerPoint. Мы помогаем школьникам, студентам, учителям, преподавателям хранить и обмениваться учебными материалами с другими пользователями.

Для правообладателей

Яндекс.Метрика