Биотехнология растений. Трансгенные растения (часть 4) презентация

….отбор по измененному фенотипу

трансформация
мутанта ag-2

трансформированное растение с цветками дикого типа

Возможность клонировать
ген, «вытянув» его за транспозон

Выращивание 26 000 растений львиного зева с активным мобильным элементом Tam3 (Transposone of Antirrhinum majus) при tº=15ºC, вызывающей наибольшую частоту транспозиций (растения М1).
Самоопыление растений М1 с целью выявления рецессивных мутаций, возникших в М1 в результате перемещения Tam3.
Выявление 15 разных гомеозисных мутаций среди 80 000 растений М2, в том числе и flo613.
Укоренение и вегетативное размножение веточек мутанта flo613 при tº=15ºC, для выявления реверсий. Генетический анализ.

Получение отпечатков клонов библиотеки на нитроцеллюлозных фильтрах
Гибридизация фильтров с меченой пробой (чаще – кДНК меченая Р32)
Авторадиография

Блот-гибридизация по Саузерну (гибридизация ДНК мутанта и дикого типа с пробой растительной ДНК фланкирующей транспозон)

Клонирование гена открывает возможность для изучения роли кодируемого им белка и мРНК во взаимодействии клеток

Возможности метода:
Выявление факторов (внешних и внутренних), определяющих особенности экспрессии исследуемого гена
Выявление цис-регуляторных элементов гена, отвечающих на действие внешних и внутренних факторов

- флуоресцентный белок - стабильный,
- позволяет определить локализацию продукта на клеточном, тканевом уровне
- не дает точной количественной оценки экспрессии (полуколичественный метод)

широко используется для изучения активности генов, т.к. позволяет выявить слабый уровень экспрессии
позволяет определить локализацию продукта на клеточном, тканевом уровне,
белок стабильный, накапливается в тканях
- не дает точной количественной оценки экспрессии (полуколичественный метод)

позволяет определить локализацию продукта на тканевом уровне,
дает наиболее точную количественную оценку
может использоваться для изучения динамических процессов (белок короткоживущий)

pCO::GUS

pSCR::GFP

ТФ GRAS

ТФ AP2-like

ТФ с В3-доменом

ТФ с GARP/ARRM-доменом

etc.

MYB

Гены семейства KNOX арабидопсиса

Гены WOX арабидопсиса и других растений

2). Развитие сложного
листа

stm

35S::
KNAT1

HD-ZIPIII

WOX

мишени: 1). гены ТФ KANADY (антагонисты HD-ZIPIII) 2). гены PIN
(регулируют транспорт ауксинов)

программы развития:

Адаксиально-абаксиальная симметрия листа

phb

WT

WT

вышележащие регуляторы: система CLAVATA
мишени: гены ARR-A -репрессоры ответа на ЦК (для WUS)

программы развития:

1). Идентичность зародыша и суспензора (WOX2 и WOX8)

2). Идентичность ПАМ и КАМ
(WUS и WOX5)

WUS

WOX5

WOX8

WOX2

По гомологии с KN1 клонированы другие гомеобоксные гены кукурузы (более 13), A.thaliana (7), табака, томатов, сои, риса, ячменя и др.

Листья A. thaliana 35S::KNAT1 превращаются из простых в пальчаторассеченные, хотя фенотип сильно варьировал (Chuck, Linkoln, Hake, 1996)

у видов с простым листом (арабидопсис, табак, кукуруза, рис) KNOX-гены экспрессируются только в АМ, но не в примордиях листьев;

у томата, имеющего сложный лист, эти гены экспрессируются и в примордиях листьев

Структура белков, содержащих MADS-домены

AP1, AP3, PI, AG, SEP1,2,3

SOC1, FLC , CAL

вышележащие регуляторы:
1). ТФ FT 2). Белки FCA и FY
2). Polycomb-комплекс VRN
мишени: ген ТФ LFY
программы развития: развитие флоральной меристемы

PHERES

вышележащие регуляторы:
Polycomb-комплекс FIS
мишени: ???
программы развития: развитие зародыша и эндосперма

35S::AP3

35S::PI

35S::AP3

35S::PI

35S::AG

Модели, описывающие процесс возникновения органов цветка:

«Последовательная» модель
Wardlow, 1957.
Порядок возникновения органов цветка отражает последовательность индуктивных сигналов (развитие органов каждого последующего круга зависит от сигналов, поступающих из предыдущих кругов

Кодирующая часть гена – последовательность, кодирующая продукт, вызывающий гибель растительных клеток и не способный перемещаться в другие клетки:
а) ген Corynebacterium diphtheriae, кодирующий дифтерийный токсин DT-A-белок, который катализирует АДФ-рибозилирование фактора элонгации. Это ведет к ингибированию белкового синтеза и гибели клеток. В состав DT-A-белка не входит сигнальный пептид, белок не является секреторным, поэтому вызывает гибель только тех клеток, где ген экспрессируется;

Глифосат – гербицид, ингибирующий синтез ароматических аминокислот путем связывания с EPSP. Токсичен для растений, E. сoli и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Прямая и обратная генетика в изучении функции гена

Подходы, используемые обратной генетикой:

Kay et al. 2009

AvrBs3 – связывается с UPA-box, активируют гены-мишени – в т.ч. Bs3, запускающий реакцию СВЧ

транскрипционный сайленсинг (регуляция экспрессии гена на уровне транскрипции)
TGS - Transcriptional gene silencing

Специфическое
разрезание мРНК (А)

Репрессия трансляции (В)

Метилирование гистонов, гетерохроматинизация (С)

DICER-подобная рибонуклеаза

mRNA

деградация транскрипта, репрессия трансляции

Конструкция, используемая для трансформации

LhGR – транскрипционный фактор (ТФ)

Неактивный ТФ

HSP90

LB

RB

RB

LB

35S

LhGR

GUS

op

PDS

PDS

intron

Экспрессия
b-глюкоронидазы (репортерного гена)

LhGR

Активный ТФ

Экспрессия
PDS- ингибирующей конструкции

DEX

Сайленсинг гена PDS

Enhancer TATA

3. Enhancer trap (ловушка для энхансера)

2. Activation tag (активирующая последовательность)

1. Геномная ДНК дикого типа

Примеры использования Т-ДНК в качестве «зондов» для выявления кодирующих и регуляторных областей (Т-DNA tagging)

TATA reporter gene

Scholte M. T-DNA tagging in Medicago truncatula. 2002

гибридный белок

Инсерция в экзон

Enhancer TATA

5. Ловушка для промотора (promoter trap) -2

reporter gene

гибридный белок

Инсерция в интрон

SD SA

Splice aceptor sequence

сплайсинг

Scholte M. T-DNA tagging in Medicago truncatula. 2002

Примеры использования Т-ДНК в качестве «зондов» для выявления кодирующих и регуляторных областей (Т-DNA tagging)

Этот путь затруднён у растений.
Введение DSB также существенно увеличивает вероятность гомологичной рекомбинации

Чтобы инактивировать конкретный локус, надо осуществить в нём разрыв двунитевой ДНК (DSB)

Ma et al., 2015

Рис дикого типа

Рис lox3

После обработки для ускоренного старения