Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ Алло - и изоплазматические линии растений Соматические гибриды у растений и животных Генетическая трансформация клеточных органелл Биотехнологические задачи и трансфор презентация

Моделирование генотипа ядерно-цитоплазматических химер

Моделирование
на уровне организма

Моделирование на уровне отдельных гибридных клеток и регенерантов, полученных из них

Моделирование на уровне геномов органелл

Транспластомные томаты

реципрокные гибриды

аллоплазматические линии

изоплазматические линии

b

B

A

a

x

А(а) х В(в) = АВ (а)

В(в) х А(а) = АВ (в)

Реципрокные гибриды являются не самой удачной моделью для изучения эффектов цитоплазматичесих генов, так как не всегда различия в фенотипе гибридов связаны с геномами органелл

Семена прямых и обратных гибридов F1 однодольных различаются геномами своих триплоидных эндоспермов – ААВ и АВВ, соответственно

Генетические различия между эндоспермами
могут вызывать различия в развитии растений,
особенно на ранних стадиях их онтогенеза

Межвидовые скрещивания Внутривидовые скрещивания

Геномы аллолиний

Белки органелл аллолиний

♀ A(мтA хпA ) х ♂B (мтB хпB) → B(мтB+AхпB+A)

.
Схема наследования ДНК органеллами при создании аллолиний путем беккроссирования (при условии строго материнского наследования органелл). А – материнское растение, В – опылитель, В(А) – аллолиния, имеющая генотип ядра В (опылителя) и геномы органелл А (исходного материнского растения).
Белки органелл аллолиний кодируются как ядром В (линии-опылителя) (бóльшая часть), так и собственными геномами органелл А (не более 1% всех белков, входящих в состав органелл).

многократное беккроссирование

B

мт

хп

♂

х

A

хп

мт

♀

“B+A”

“B+A”

B

“А” - белки пластид и митохондрий,
кодируемые ДНК органелл

“В” - белки пластид и митохондрий,
кодируемые ДНК ядра

Аллолиния В(А)

Аллолиния В(А)

B

А

A

многократное беккроссирование

мт

хп

♂

х

A

хп

мт

♀

B

В 1951 году японский генетик Kихара создал
первую серию аллоплазматических линий

Triticum aestivum

Aegilops ovata

Донор ядра, мягкая пшеница

Донор цитоплазмы, дикий злак

Сейчас коллекция аллоплазматической пшеницы, созданной в Японии учениками и последователями Kihara, включает линии с ядерными генотипами 12 сортов гексаплоидной мягкой пшеницы и цитоплазматическими геномами 8 различных видов пшениц (10 источников) и 24 видов эгилопсов (36 источников) – всего 552 комбинации

Влияние генома органелл на процессы и свойства растений, изученные с помощью аллолиний

экспрессия ядерных генов, контролирующих морфологические и количественные признаки

фертильность

фотосинтетические и респираторные параметры           

устойчивость к патогенам и другим стрессовым факторам

морфогенетические потенции

конъюгацию хромосом, трансмиссию и рекомбинацию отдельных компонентов ядерного генома

В последующее десятилетие это направление пережило настоящий бум: были опубликованы десятки работ, сообщавшие более чем о 70 экспериментах на различных видах

Nicotiana

Glycine

Daucus

Petunia

Solanum

Brassica

Arabidopsis

цибриды

Чьи органеллы обнаруживаются у цибридов ?

N. tabacum

+

P. hybrida

N. tabacum – ядро
N. tabacum митохондрии
P. hybrida- пластиды

Цибрид жизнеспособный

N. tabacum – ядро
~ " N. tabacum " митохондрии
P. hybrida- пластиды

Цибрид аномальный
(митохондриальная ДНК рекомбинантная)

Митохондрии P. hybrida несовместимы с ядром N.tabacum

Сегрегация пластид у цибридов может происходить в пользу как одного, так и другого родителя

Если пластиды одного вида чем-то повреждены

При повреждении пластид гербицидом цибриды гомопластидны

Как ведут себя органеллы у цибридов?
Иногда сегрегация происходит очень быстро, иногда для этого нужно до 20 клеточных поколений

Получены цибриды:

Попытка создать межсемейственный цибрид
Solanum nigrum + N. tabacum успехом не увенчались

Что происходит с их геномами в этот период?

Рекомбинация хлоропластных ДНК– явление крайне редкое, либо редко обнаруживаемое у наземных растений

Гораздо чаще рекомбинации хлоропластных ДНК наблюдаются у межвидовых гибридов одноклеточной зеленой водоросли Сhlamydomonas

Рекомбинации митохондриальных ДНК удается выявлять значительно чаще, чем хлоропластных. Кроме родительских молекул мтДНК у соматических гибридов, как правило, обнаруживаются также новые последовательности, которые обычно являются результатом рекомбинаций между исходными типами мтДНК

История гибридизации соматических клеток животных еще более длительная, чем у растений

При клонировании животных только 1-5% реконструированных эмбрионов доживают до взрослых животных

Энуклеация ооцита -микроманипуляция

При этом утрата мтДНК опережает сегрегацию хромосом одного из родителей

Сегрегация митохондриальной ДНК мыши в клеточных гибридах мыши и человека была показана уже в ранних работах

Быки из Индии

Многократное спаривание

Ядерный геном постепенно замещался на В. indicus, тогда как митохондрии (которые передаются по материнской линии) - остались от B. taurus

При экспериментальных попытках замены цитоплазмы у животных прибегают к прямой реконструкции путем переноса ядра в ооцит

У широко известной овечки Долли, впервые клонированной из соматической клетки, перенесенной в ооцит другой овцы, мтДНК отличалась от таковой донора ядра и полностью соответствовала мтДНК ооцита хозяина

Предварительная энуклеация

Перенос ядра крысы

ооцит мыши

Развитие цибрида блокируется на стадии 1-2 клеток

ооцит мыши

Развитие цибрида блокируется на стадии 5-8 клеток

ооцит мыши

Перенос ядра крысы

Перенос цитоплазмы крысы

Развитие цибрида идет до стадии морулы

Ядро крысы неспособно существовать в цитоплазме мыши

Митохондрии Bos indicus + Bos taurus

При дальнейших циклах деления данной цибридной клетки количество копий митохондриальной ДНК Bos indicus быстро уменьшалось, и животное-регенерант, полученное при имплантации в корову зародыша на стадии бластоциста, содержало митохондриальные ДНК исключительно от Bos taurus (разрешающая способность измерений составляла 0,05% мтДНК)

ИТАК,
попытки конструирования клеточных химер в ряде случаев увенчались успехом и у животных, и у растений. Практически полезных химер немного. Но – они позволили познать ряд механизмов ядерно-цитоплазматического взаимодействия

Транспластомные растения – растения с трансгенами, встроенными в пластидный геном

При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома

Селективный пластидный маркер, обеспечивающий отбор трансформантов

Система культивирования, обеспечивающая эффективную регенерацию

Частицы золота или вольфрама диаметром от 0.4 до 1.7 микрона, покрытые ДНК трансформирующих плазмид

Частицы проникают в клетки и клеточные органеллы

Трансформационный вектор пластид pZS148 состоит из pBluescript KS+ вектора, в который встроен Sac I–EcoRV фрагмент пластидной РНК. Выделена светлым 16S рДНК.
Указаны относительные позиции мутаций резистентности к антибиотикам стрептомицину (str-1) и спектиномицину (spc-2) и Pst1 линкера (*). 2.9-т.п.н. Sal 1 фрагмент включает область, связанную с репликацией (pt ori) al.,

Признак устойчивости к антибиотику был первым, перенесенным в пластиды табака

Из 148 обстрелянных листьев табака было отобрано три транспластомных устойчивых клона

ген В ген С

A

B

Включение чужеродного гена (ген Т) в пластом путем генетической трансформации

Плазмида встраивается в пластидный геном в строго определенном месте, а именно туда, где находятся последовательности, гомологичные имеющимся в плазмиде

Конструкция оказывается стабильно включенной в пластом

При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома

Размер фланкирующих гомологичных хпДНК последовательностей с каждой стороны должен составлять не менее 1 т.п.н., размер гетерологичной последовательности при этом может изменяться от 1.3 до 3.7 т.п.н

Как удается встроить в пластом чужеродные гены?

Почему транспластомные растения перспективнее трансгенных?

1. Высокий уровень экспрессии трансгена и накопления чужеродного белка.
Причина - полиплоидность пластидных генетических систем и высокая стабильность чужеродных белков в пластидах.

2. Возможность экспрессировать в пластидах целые бактериальные опероны, отвечающие за какой-либо биосинтетический путь.

3. Трансгены встраиваются в пластидный геном по принципу гомологичной рекомбинации, в ядерный - хаотично. Следовательно, все трансформанты пластид возникающие из одной и той же конструкции, находятся в совершенно равноценном положении и значит не отличаются уровнем экспрессии трансгена

5. Не происходит бесконтрольного переноса пластидных трансгенов с пыльцой (почему?)

Встраивание гена Bt в хлоропластный геном табака

Растения проявляли устойчивость к личинкам травоядных насекомых

В дальнейшем титр токсина удалось повысить до 45% от общего растворимого белка клетки, при этом в хлоропластах образовывались кристаллы белка-токсина

!!!

Наблюдалась 100%-ая гибель насекомых после дегустации трансформированных листьев

Гормон в пластидах правильно укладывался во вторичную структуру

Далее – предполагалось использовать протоколы трансформации пластид для основных пищевых культур

Для получения транспластомных растений картофеля и томатов потребовалось еще 10 лет

Концентрация рекомбинантного белка в клетке более чем в 300 раз превышала таковую при трансформации данным геном ядерного генома

Антитела и другие фармакопрепараты

Первые успехи по пластидной трансформации достигнуты у арабидопсиса, риса, видов Brassica

“plantibodies”

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ

atp6 atp8
atp9

N m

atp6
atp9

N m

atp6
atp9

N m

TpN-atp8art

atp6 atp8

TpN-atp9

N m

Sc wt

Sc
mit -

Sctr

TpN-atp8art

N9/Y8

pLF1

у нейроспоры ген субъединицы
9 переместился в ядро

Гены трех субъединиц ATP (6,8,9) у дрожжей находятся в митохондриях

Последовательность синтезирована химическим путем in vitro