Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы Виктория Шкарупо презентация

Шкарупо

Лаборатория Молекулярной генетики человека
НИЦ Молекулярной медицины
ММА им.И.М.Сеченова

– один из наиболее ранних процессов канцерогенеза
Частоты аномального метилирования множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе
Выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна
Анализ метилирования одного гена технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР с одной-тремя парами праймеров. Поиск же мутаций в одном гене требует использования до нескольких десятков пар праймеров, кроме того, удовлетворительная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР.

РНК

Стабильность ДНК значительно выше
Аномально метилированную ДНК можно детектировать в плазме крови и других биологических жидкостях (неинвазивные / низкоинвазивные тесты)
Аномальное метилирование – качественный, а не количественный признак, поэтому на достоверность его определения не влияет присутствие молекул нуклеиновых кислот из нормальных тканей

на уровне единичных маркеров
Удовлетворительная специфичность молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза достигается только при использовании систем десятков маркеров

ранее опубликованных подходов; выбор и обоснование методической базы исследования
Разработка лабораторного протокола метода скрининга дифференциального метилирования ДНК
Разработка методов картирования выявляемых дифференциально метилированных локусов
Проведение скрининга дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы (РМЖ); характеристика нормальных и опухолевых метилотипов
Картирование и характеристика частот аномального метилирования конкретных выявленных локусов при РМЖ

Задачи:

фрагментов

2. Рестрикционное картирование на основании анализа AIMS in silico

silico

C2CD2-5’-CpG

Межгенный13q32.1-CpG

PHF-5’-CpG

12q13.13-5’-CpG
неохарактеризованные сплайсируемые РНК

Рестриктаза NotI - C2CD2-5’-CpG

Рестриктаза AscI - PHF-5’-CpG

Рестриктаза GsaI - межгенный CpG-островок 13q32.1

Рестриктаза AvrII - 12q13.13-5’-CpG

5’-CpG

FOXM1-5’-CpG

ANK3- 5’-CpG

мере одного из 30 проанализированных CpG-островков.

особенностей метилирования различных структурно-функциональных элементов генома

Скрининг аномального метилирования в диагностике, в т.ч. ранней.

Области применения

ст.н.с.

Спасибо за внимание !

ДНК
О – отрицательный контроль ПЦР (H2O)
П – положительный контроль ПЦР (ДНК)
о – гидролизованная ДНК из тканей опухолей
н - гидролизованная ДНК из прилежащих нормальных тканей

– анализируемые гены

НВВ – внутренний контроль ПЦР

амплификации неметилированных Alu- повторов
- количественного анализа совокупного геномного метилирования Alu-повторов
- детекции экстраметилированных сайтов
- детекции экстранеметилированных сайтов

Анализ результатов фрагментного анализа

дискриминирующих различные геномные элементы, например, CpG-островки или рассеянные повторы.
удлинителей праймеров, ограничивающих количество ожидаемых продуктов АИМС до значений, приемлемых при анализе капиллярным электрофорезом.

Выбор:

хроматина.