Физика и структурная биология в начале XXI века И. Н. Сердюк Лаборатория физики нуклеопротеидов, Институт Белка РАН, г. Пущино. и Лаборатория нейтронной физики, Объединенный Институт Ядерных Исследований, г. Дубна 22 Февраля, 2005 презентация

нуклеопротеидов,
Институт Белка РАН, г. Пущино.
и
Лаборатория нейтронной физики,
Объединенный Институт Ядерных Исследований, г. Дубна

22 Февраля, 2005

Ядро

т-РНК

Белок

Хромосома, нуклеосома, ДНК
Факторы транскрипции
Матричная РНК
Рибосома, т-РНК, аминокислоты
Факторы трансляции
Разнообразные белки
Линейные и вращательные молекулярные моторы

Схематическое изображение клетки Е.Coli.

Цитоплазма

Ядро

Мембрана

Мотор

Амино кислота

ДНК приводит к образованию двух гибридных молекул, состоящих из родительской и дочерней цепи. Обе гибридные молекулы идентичны друг другу и полностью повторяют исходную цепь.

Схематическое изображение двойной спирали (слева) и структуры «бок о бок» (справа). Обратите внимание, что общие размеры (c- шаг спирали и 2а- диаметр спирали) в обоих случаях одинаковы.

A

T

Г

Ц

А

Т

Ц

Г

Упорядоченные волокна ДНК

двух α-цепей и двух β-цепей. Каждая глобиновая цепь состоит из 8 спиралей, связанных короткими перемычками и образующих карман, в котором помещается группа гема.

Гемы

β-цепь

β-цепь

α-цепь

α-цепь

детекторов
Девиз: «NCNG”

30S

2.7 Å

синхротронного кольца. Они удерживают пучок электронов на круговой орбите.
Ондуляторы располагаются между магнитами. Они содержат большое число магнитных полюсов, позволяющих сформировать хорошо сфокусированный узкий пучок (расходимость около 0.001 градуса).Кроме того они позволяют существенно увеличить яркость пучка и его когерентность.

Экспериментальные установки

ESRF в Гренобле (Франция)- самый мощный синхротронный источник в мире (Ø кольца ~300 м).

из тяжелого металла
Orela
Окридж, США
(1.3×1014 н/см2сек)

Ускоритель протонов + мишень из тяжелого металла
ISIS, Англия
(1.3 ×1015 н/см2сек)
SINQ, Швейцария
( 2×1014 н/см2сек)

Мигающие (с тратой энергии)

Активная зона с подвижным отражателем
ИБР-2, Россия
2×1016 н/см2сек

Обогащенный уран
U-235
HFR (60 MW)
Гренобль,Франция
2×1015 н/см2сек

Обогащенный уран
U-235
PIK (100 MW)
Гатчина, Россия
5×1015 н/см2сек

с разрешением 2 Å. Такое разрешение эквивалентно 0.9 Å рентгеновскому.
696 атомов водорода и 264 атомов дейтерия показаны небольшими сиреневыми и зелеными сферами, соответственно.
Атомы кислорода и углерода показаны большими красными и зелеными сферами, соответственно.

Нейтронная белковая кристаллография: лизоцим

белков и нуклеиновых кислот 2H, 13C, 15N, расширение рабочей частоты ЯМР до 1 ГГz - все эти инновации привели к тому, что сегодня ¼ всех биологических структур с высоким пространственным разрешением получается методом ЯМР.

1D и 2D ЯМР спектры небольшого белка, протеазного ингибитора K (57 аминокислот) в 0.01 M, pD 3.4, 25oC, 360 MHz.

1D 1H спектр

Этажерочное представление
COSY спектра

Контурное представление COSY спектра. Третья координата - интенсивность.

работают при очень высокие концентрациях вещества (число молекул в образце составляет 1015)
2) не позволяют видеть, как функционируют биологические молекулы в реальном режиме времени
3) не позволяют видеть, как функционирует одна биологическая молекула.

Новые физические подходы,
Принципиальный переход от исследования макромолекул в больших объемах (доли миллилитра) к исследованию макромолекул в предельно малых объемах (доли аттолитра).
Уникальная возможность перейти от описания свойств макромолекул в ансамбле к описанию их свойств на одиночном уровне.

«Мы никогда не сможем работать с одиночными электронами, атомами и молекулами» (Эрвин Шредингер, 1952)

Исследование структуры и функционирования одиночных биологических макромолекул


Детектирование одиночных флюоресцентно меченых молекул с помощью лазерной флюоресценции в предельно малых объемах (аттолитры)
Конфокальная микроскопия
Микроскопия ближнего поля
Визуализация одиночных макромолекул
Микроскопия силового поля
Манипулирование одиночными биологическими макромолекулами (растягивание модулярных белков и РНК, скручивание, растягивание, расcтегивание, разгрызание одиночных двойных спиралей ДНК, сборка и разборка нуклеосом
Микроскопия силового поля
Оптические и магнитные ловушки
Визуализация и описание работы линейных и роторных биологических моторов в терминах сил (пиконьютоны) и расстояний (нанометры), сопровождающих каждую фазу их рабочего цикла

1 attoliter= 10-18 L, 1 piconewton = 10-12 N, 1 nanometer = 10-9 m

тем чтобы дать максимальное число фотонов за время эксперимента.

Диаграмма поглощения и испускания цвета в явлении флюоресценции

белках, а также минорные основания в т-РНК

Внешние метки: dansyl chloride, 8-anilino-1- naphthalen sulfonat, 1, etidium bromide,
iodacetamide, maleimide, and много других

Зеленый флюоресцентный белок из медузы Aequorea victoria

Вторичная структура зеленого флюоресцентного белка из медузы.
Хромофор
(p-hydroxybenzylideneimidazolidinone)

Green-FP, Cyan-FP, Yellow-FP,

Кристаллическая структура зеленого белка с последовательностью Thr65-Tyr66-Gly67 и его мутантов. Структура напоминает плетеную корзину из 11 спиралей длиной 42Å и диаметром 24Å

энергии (FRET), флюорофор, называемый донором (D), переносит часть энергии на флюорофор, называемый акцептором. (А). Такой перенос энергии возможен только в том случае, если спектр эмиссии донора перекрывается со спектром поглощения акцептора и . флюорофор (А) находится на определенном расстоянии от флюорофора (D)

FRET позволяет измерить расстояние между донором и акцептором, поскольку перенос энергии EТ очень сильно расстояния между флюорофорами

где R0 (nm), есть расстояние на котором 50% перенос энергии имеет место.

(F3.5)

белков (Yellow-FP и Cyan-FP) в разных ее компартментах.
Каждый из GFP-белков присоединен к определенному исследуемому белку.

GFP как диагностик взаимодействия белков с лигандами

Принципиальная схема опыта, в которой GFP используется как конформационный индикатор взаимодействия белков с лигандами.
После связывания белка с лигандом измеряется перенос энергии между донором (GFP) и акцептором (Cy3). Перенос энергии очень чувствителен к расстоянию донор-акцептор.

аттолитров

Двухфотонное возбуждение в лазерной наведенной флюоресценции

Микроскопия ближнего поля

Флюоресцентная микроскопия в режиме полного внутреннего отражения
Конфокальная микроскопия

in fluorescence.

Предельно малый обьем

основанная на принципе «оптического стетоскопа», помещающегося на максимально коротком расстоянии от образца (меньше длины волны). Изображение получается сканированием стетоскопа вдоль образца. Пространственное изображение ограничено диаметром светового сопла.

Одиночные молекулы
сульфородамина на стеклянной поверхности.

Диаметр 700 Å

Оптическое волокно

Одиночная молекула

обьем возбуждения ~ 20 attoлитров

3000 Å

Падающий лазерный луч

Кварц

Раствор

Затухающая стоячая волна

диафрагмы.

Демонстрация получения конфокального изображения. Три точки: клетка 1, точечная диафрагма и источник света взаимно конфокальны

Формирование линзой изображения тонкого образца в присутствии точечной диафрагмы.

the surface of platinum crystal

A Liquid crystal (8CB) on graphite. Benzene rings are revealed.

Strands Z-DNA laying on graphite

Вакансия

Бензольное кольцо

ДНК?

содержит линзы как таковой для формирования изображения. Она использует острие “атомных” размеров на конце длинной гибкого “удилища”. Острие сканирует поверхность молекулы.
Работа острия напоминает работу палочки слепого.

Наноцилиндр
из C60

«Сердце» микроскопа – гибкое удилище

Острие “атомных“ размеров

Контактная мода

Осциллирующая мода

200 нм

кристаллическая структура

Три последовательных изображения ( 0, 12 и 24 минуты) показывают разрезание ДНК рестрикционной нуклеазой Bal 31.

спирали 24 Å

на подложке из планарных липидных бислоев.

Прямая визуализация дефектов в кристаллах аннексина

19 мин.

23 мин

26 мин

29 мин

31 мин

34 мин

интенсивного лазерного пучка.

Типичное видео изображение магнитной бусинки (Ø 2.9 микрон) и микропипетки в оптическом микроскопе.

В типичном эксперименте острие укосины вдавлива-ется в слой белка, привязан- ного к золотой подложке. Затем подложка опускается вниз под действием пьезо-электрической силы.

втягивает в фокус маленькие коллоидальные частицы. Радиационное давление несколько смещает частицу вдоль оптической оси.

Оптический твизер

одиночной молекулы в методе AFM

«Полибелок» состоит из множественных копий белка.

при приложении силы.

Human cardiac titin immunoglobulin

204 ± 26 pN

60 ± 20 pN

Single C2 domain

Rat calmodulin (CaM4)

20 ± 20 pN

с помощью оптического твизера (диаметр на 30% меньше исходной)
(Cправа P-DNA), полученная скручиванием B-DNA с помощью магнитного твизера. Примечательно, что в такой ДНК основания смотрят наружу.

B→S

Растягивание ДНК

Скручивание ДНК

B→P

Величина силы для перехода ДНК из В- в P- форму ~ 20 pN

Величина сила для перехода ДНК из B- в S- форму ~ 65 pN

моторы движутся вдоль полимерных субстратов за счет энергии АТФ.

Скорость работы 200 нуклeотидов/сек

типа платформы:
Реальная величина шага передвигающегося миозина скорее всего ожидается с кратностью 5.5 нм, которое соответствует расстоянию между мономерами актина.
РНК- полимераза движется с шагом 0.34 нм, которое соответствует шагу спирали ДНК.
Кинезин движется с шагом 8 nm, что соответствует расстоянию между отдельными белками микротрубочки.

АТФ.

Экспериментальная схема прямого наблюдения вращения F1 мотора. Мотор вращается со скоростью 4 оборотов/сек и шагом 120о.

Рентгеновскаяструктура комплекса с разрешением около 2.2 Å

Мембрана
митохондрии

F0

F1

F0

F1

располагающегося внутри клетки, втулки с различными уплотняющими манжетами в мембране, крюка и пропеллера длиной 10 μm , располагающегося вне клетки (на рисунке не показан). В клетке E. Coli пропеллер вращается со скоростью 18.000 оборотов в минуту и двигает клетку со скоростью 30 μм/сек.

Мотор

Крюк

Втулка

Мембрана

Ядро

Цитоплазма

Ротор, статор, уплотняющие манжеты, кольца…

Cambridge, 2005

Introduction. From thermodynamic to single molecule detection

Section A. Biological macromolecules and Physical Tools

Section B. Mass and charge

Section D. Hydrodynamics

Section C. Thermodynamics

Section E. Optical Spectroscopy

Section F. Optical Microscopy

Section G. X-ray and Neutron Diffraction

Section H. Energy and Time

Section J. Atomic resolution imaging

Section K. Nuclear magnetic resonance

Conclusion. Back to beginning…

одиночным молекулам
Лекция 1. Макромолекулы как гидродинамические частицы
Лекция 2. Диффузия, ультрацентрифугирование, электрофорез
Лекция 3. Ориентация макромолекул в электрическом и гидродинамическом поле, вязкость,
Лекция 4. Динамическое рассеяние света, флюоресцентная корреляционная спектроскопия,
световая микроскопия
Лекция 5. Флюоресцентная микроскопия, атомная силовая микроскопия, исследования на
одиночных молекулах
Лекция 6. Масс спектрометрия и термодинамика
Лекция 7. Абсорбционная и инфракрасная спектроскопия, Рамановское рассеяние, оптическая
активность
Лекция 8. Ядерный магнитный резонанс
Лекция 9. Макромолекулы как рассеивающие частицы. Рентгеноструктурный и нейтроноструктурный
анализ
Лекция 10. Малоугловое рассеяние, электронная микроскопия, двумерная инфракрасная
спектроскопия

Московский и Пущинский Государственные Университеты

Центр подготовки специалистов при ИБ РАН. www.mbec.protres.ru

поверхность кристалла (p-terpenyl crystal at 1.8 K). Концентрация молекул составляет (10-7-10-9 M) (Moerner and Orrit, 1989).

Изображения флюоресцентно меченых липидов на поверхности мембраны:

А. Три разные концентрации липидов

Б. Девять последовательных изображений поверхности снятые через определенные промежутки времени (35 микросек) при самой низкой концентрации липидов. Вычисленный коэффициент диффузии Dlat= 1.42 10-8 cm2/sec
(Schmidt, et al, 1996)

А

Б