- Главная
- Разное
- Дизайн
- Бизнес и предпринимательство
- Аналитика
- Образование
- Развлечения
- Красота и здоровье
- Финансы
- Государство
- Путешествия
- Спорт
- Недвижимость
- Армия
- Графика
- Культурология
- Еда и кулинария
- Лингвистика
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Маркетинг
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Генетическая инженерия презентация
Содержание
- 1. Генетическая инженерия
- 2. АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности) Провести BLAST
- 3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
- 5. Step 2: Choose the BLAST program
- 7. Форматы файлов, используемых в биоинформатике FASTA
- 9. Step 3: choose the database nr
- 10. Step 4a: Select optional search parameters Entrez! algorithm organism page 107
- 11. Scoring matrix Вероятность нахождения последовательностей
- 12. Автоматическая подстройка под параметров
- 13. АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности) Поиск в
- 16. Дополнительный анализ последовательности http://www.bioinformatics.org/sms2/
- 18. Анализ белкового продукта гена
- 19. АЛГОРИТМ РАБОТЫ НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В
- 20. Вектора – что нужно учитывать
- 21. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
- 22. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
- 23. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
- 24. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
- 25. Область полилинкера –
- 26. Область полилинкера
- 27. Область полилинкера
- 28. Область полилинкера
- 29. 1 этап НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА. Bioinformatics.org/SMS/
- 30. Область полилинкера вектора Уникальные сайты
- 31. АЛГОРИТМ РАБОТЫ ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ САЙТОВ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА. Bioinformatics.org/SMS/
- 32. Последовательность целевого гена Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccgattgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaagcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcattatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacgggggccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttagtgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccaccatcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctttccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggactggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaataaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcaccacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagcacttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgccgccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgccatgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgactagcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaattaatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa
- 33. Сайты в последовательности целевого гена
- 34. Анализ сайтов рестрикции
- 36. Сайты в последовательности целевого гена
- 37. АЛГОРИТМ РАБОТЫ ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ
- 38. Область полилинкера вектора Уникальные сайты
- 39. АЛГОРИТМ РАБОТЫ ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ). Bioinformatics.org/SMS/
- 40. Последовательность целевого гена Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccgattgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaagcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcattatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacgggggccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttagtgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccaccatcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctttccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggactggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaataaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcaccacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagcacttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgccgccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgccatgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgactagcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaattaatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa
- 41. Подбор праймеров 5’- Atgactgccacgattcc…………-----……………………………………………………cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
- 42. Подбор праймеров 5’- Atg act gcc acg
- 43. Подбор праймеров 5’- Atgactgccacgattcc…………-----……………………………………………………cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
- 44. Подбор праймеров 5’- Atg act gcc acg
- 45. Прямое клонирование Сайты рестрикции можно ввести в
- 46. АЛГОРИТМ РАБОТЫ ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ
- 47. Область полилинкера вектора Уникальные сайты
- 48. Введение сайтов рестрикции в праймеры 5’- Atg
- 49. Расчет температуры отжига праймеров (A+T)*2+(C+G)*4 (для праймеров
- 50. Прямое клонирование Две пары праймеров: Одна
- 51. Прямое клонирование Провести ПЦР с первой парой
- 52. Прямое клонирование Провести ПЦР, используя ПЦР-продукт первой
- 53. Прямое клонирование Через Т-вектор (в случае использования
- 54. Введение сайтов рестрикции в праймеры 5’- Atg
- 55. АЛГОРИТМ РАБОТЫ СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.
- 56. Схема клонирования целевого гена в
- 57. Т-вектор
АЛГОРИТМ РАБОТЫ
(анализ последовательности) Провести BLAST целевой последовательности Определить гомологов Определить потенциальную функцию белка Дать статистическую оценку найденным гомологам
Слайд 2АЛГОРИТМ РАБОТЫ
(анализ последовательности)
Провести BLAST целевой последовательности
Определить гомологов
Определить потенциальную функцию белка
Дать статистическую
оценку найденным гомологам
Слайд 7Форматы файлов, используемых в биоинформатике
FASTA
>roa1_drome Rea guano receptor type III >>
0.1
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPRTKRSRGFGFITYSHSSMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHFGNIVDNIVIDKETGKKRGFAFVEFDDYDPVDKVVLQKQHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY
>roa2_drome Rea guano ligand
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPTSTSTSTSTSTSTSTSTMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHLLLLLLLDLLLLDLLLLDLLLFVEFDDYDPVDKVVLQK
QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPRTKRSRGFGFITYSHSSMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHFGNIVDNIVIDKETGKKRGFAFVEFDDYDPVDKVVLQKQHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY
>roa2_drome Rea guano ligand
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPTSTSTSTSTSTSTSTSTMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHLLLLLLLDLLLLDLLLLDLLLFVEFDDYDPVDKVVLQK
QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY
Слайд 9Step 3: choose the database
nr = non-redundant (most general database)
dbest
= database of expressed sequence tags
dbsts = database of sequence tag sites
gss = genomic survey sequences
dbsts = database of sequence tag sites
gss = genomic survey sequences
protein databases
nucleotide databases
Слайд 11
Scoring matrix
Вероятность нахождения последовательностей с таким же скором по случайным причинам
Этап
4a: Изменения необязательных параметров
Максимальное кол-во выравниваний в выдаче
Слайд 12
Автоматическая подстройка под параметров под короткие последовательности
Для белка стандартно - 3,
можно установить 2 для короткого белка, или 4-5 для более точного поиска
Этап 4a: Изменения необязательных параметров
Автоматическая подстройка под контекстные особенности организмов (GC состав)
Слайд 13АЛГОРИТМ РАБОТЫ
(анализ последовательности)
Поиск в базах данных всей известной информации:
http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi
Слайд 19АЛГОРИТМ РАБОТЫ
НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА.
ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ САЙТОВ В
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА.
ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ, КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА). Учитывать направление промотора!!!
ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ).
ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ.
СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.
ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ, КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА). Учитывать направление промотора!!!
ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ).
ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ.
СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.
Слайд 30Область полилинкера вектора
Уникальные сайты
(в области полилинкера):
BamHI – GGA TCC
SphI –
GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT
Слайд 31АЛГОРИТМ РАБОТЫ
ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ САЙТОВ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА.
Bioinformatics.org/SMS/
Слайд 32Последовательность целевого гена
Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccgattgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaagcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcattatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacgggggccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttagtgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccaccatcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctttccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggactggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaataaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcaccacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagcacttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgccgccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgccatgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgactagcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaattaatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa
Слайд 37АЛГОРИТМ РАБОТЫ
ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ,
КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА).
Слайд 38Область полилинкера вектора
Уникальные сайты
(в области полилинкера):
BamHI – GGA TCC
SphI –
GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT
Слайд 39АЛГОРИТМ РАБОТЫ
ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ).
Bioinformatics.org/SMS/
Слайд 40Последовательность целевого гена
Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccgattgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaagcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcattatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacgggggccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttagtgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccaccatcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctttccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggactggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaataaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcaccacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagcacttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgccgccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgccatgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgactagcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaattaatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa
Слайд 41Подбор праймеров
5’- Atgactgccacgattcc…………-----……………………………………………………cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
Прямой праймер – такой же как последовательность
в 5’ области целевого гена.
Почему?
Почему?
Слайд 42Подбор праймеров
5’- Atg act gcc acg att cc…………-----
3’ Tac tga cgg
tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер – «садится» на комплементарную цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность совпадает. В нашем случае: 5’- atg act gcc acg att cc – 3’
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер – «садится» на комплементарную цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность совпадает. В нашем случае: 5’- atg act gcc acg att cc – 3’
Слайд 43Подбор праймеров
5’- Atgactgccacgattcc…………-----……………………………………………………cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
Обратный праймер – пишется с учетом правила
комплементарности.
Почему?
Почему?
Слайд 44Подбор праймеров
5’- Atg act gcc acg att cc…………-----
3’ Tac tga cgg
tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Обратный праймер – «садится» на первую цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность должна быть ей комплементарна. В нашем случае – 3’- gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
При заказе на синтез – праймер «переворачивают и пишут следующим образом: 5’- t taa act ttt ttc agg gag - 3’
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Обратный праймер – «садится» на первую цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность должна быть ей комплементарна. В нашем случае – 3’- gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
При заказе на синтез – праймер «переворачивают и пишут следующим образом: 5’- t taa act ttt ttc agg gag - 3’
Слайд 45Прямое клонирование
Сайты рестрикции можно ввести в 5’-область праймера
Провести ПЦР
Сделать гидролиз
ПЦР-продукта и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции
Провести лигирование целевого фрагмента и вектора
Провести лигирование целевого фрагмента и вектора
Слайд 46АЛГОРИТМ РАБОТЫ
ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ.
Были выбраны
сайты для SphI – GCA TGC и SmaI – CCC GGG
Слайд 47Область полилинкера вектора
Уникальные сайты
(в области полилинкера):
BamHI – GGA TCC
SphI –
GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT
Слайд 48Введение сайтов рестрикции в праймеры
5’- Atg act gcc acg att cc…………-----
3’
Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
SmaI – CCC GGG
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
SmaI – CCC GGG
Слайд 49Расчет температуры отжига праймеров
(A+T)*2+(C+G)*4 (для праймеров до 20-25 п.н.)
Для праймеров большей
длины более сложное:
22+1,46(2*(G+C) +(A+T))
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
(14)*2+(15)*4= 88 градусов
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
(16)*2+(14)*4= 88 градусов
22+1,46(2*(G+C) +(A+T))
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
(14)*2+(15)*4= 88 градусов
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
(16)*2+(14)*4= 88 градусов
Слайд 50Прямое клонирование
Две пары праймеров:
Одна пара строго на последовательность целевого гена
Прямой
праймер: 5’- atg act gcc acg att ccg att– 3’
(11)*2+(10)*4= 62 градуса
Обратный праймер: 5’- t taa act ttt ttc agg gag ggc - 3’
(13)*2+(9)*4= 62 градуса
(11)*2+(10)*4= 62 градуса
Обратный праймер: 5’- t taa act ttt ttc agg gag ggc - 3’
(13)*2+(9)*4= 62 градуса
Слайд 51Прямое клонирование
Провести ПЦР с первой парой
Подобрать вторую пару праймеров с введенными
сайтами рестрикции (уменьшая число нуклеотидов, соответствующих целевой последовательности для оптимизации температуры отжига)
Слайд 52Прямое клонирование
Провести ПЦР, используя ПЦР-продукт первой реакции в качестве матрицы
Сделать гидролиз
второго ПЦР-продукта и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции
Провести лигирование целевого фрагмента и вектора
Провести лигирование целевого фрагмента и вектора
Слайд 53Прямое клонирование
Через Т-вектор (в случае использования Taq-полимеразы)
Тогда сайты рестрикции можно ввести
в 5’-концевую часть праймера без добавления нуклеотидов
Слайд 54Введение сайтов рестрикции в праймеры
5’- Atg act gcc acg att cc…………-----
3’
Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
SmaI – CCC GGG
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
SmaI – CCC GGG
Слайд 56
Схема клонирования целевого гена в вектор.
Вектор
Целевая последовательность
Проводим ПЦР с подобранными
праймерами.
2. Клонируем (ПЦР-продукт в Т-вектор).
3. Гидролизуем Т-вектор со вставкой
целевого гена SphI и SmaI.
4. Проводим разделение
в агарозном геле.
5. Фрагмент ДНК соответствующего
размера выделяем из геля и
6. Используем для лигирования в экспрессионный вектор.
1. Гидролизуем вектор SphI и SmaI.
2. Проводим разделение
в агарозном геле.
3. ДНК выделяем из геля и
4. Используем для лигирования с последовательностью целевого гена.
