Генетическая инженерия презентация

оценку найденным гомологам

0.1
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPRTKRSRGFGFITYSHSSMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHFGNIVDNIVIDKETGKKRGFAFVEFDDYDPVDKVVLQKQHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY
>roa2_drome Rea guano ligand
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPTSTSTSTSTSTSTSTSTMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHLLLLLLLDLLLLDLLLLDLLLFVEFDDYDPVDKVVLQK
QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY

= database of expressed sequence tags
dbsts = database of sequence tag sites
gss = genomic survey sequences

protein databases

nucleotide databases

4a: Изменения необязательных параметров

Максимальное кол-во выравниваний в выдаче

можно установить 2 для короткого белка, или 4-5 для более точного поиска

Этап 4a: Изменения необязательных параметров

Автоматическая подстройка под контекстные особенности организмов (GC состав)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА.
ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ, КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА). Учитывать направление промотора!!!
ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ).
ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ.
СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.

GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT

КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА).

GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT

в 5’ области целевого гена.
Почему?

tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’

Прямой праймер – «садится» на комплементарную цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность совпадает. В нашем случае: 5’- atg act gcc acg att cc – 3’

комплементарности.
Почему?

tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’

Обратный праймер – «садится» на первую цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность должна быть ей комплементарна. В нашем случае – 3’- gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
При заказе на синтез – праймер «переворачивают и пишут следующим образом: 5’- t taa act ttt ttc agg gag - 3’

ПЦР-продукта и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции
Провести лигирование целевого фрагмента и вектора

сайты для SphI – GCA TGC и SmaI – CCC GGG

GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT

Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’

Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
SmaI – CCC GGG

длины более сложное:
22+1,46(2*(G+C) +(A+T))
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
(14)*2+(15)*4= 88 градусов
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
(16)*2+(14)*4= 88 градусов

праймер: 5’- atg act gcc acg att ccg att– 3’
(11)*2+(10)*4= 62 градуса
Обратный праймер: 5’- t taa act ttt ttc agg gag ggc - 3’
(13)*2+(9)*4= 62 градуса

сайтами рестрикции (уменьшая число нуклеотидов, соответствующих целевой последовательности для оптимизации температуры отжига)

второго ПЦР-продукта и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции
Провести лигирование целевого фрагмента и вектора

в 5’-концевую часть праймера без добавления нуклеотидов

Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’

Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’
SmaI – CCC GGG

праймерами.
2. Клонируем (ПЦР-продукт в Т-вектор).
3. Гидролизуем Т-вектор со вставкой
целевого гена SphI и SmaI.
4. Проводим разделение
в агарозном геле.
5. Фрагмент ДНК соответствующего
размера выделяем из геля и
6. Используем для лигирования в экспрессионный вектор.

1. Гидролизуем вектор SphI и SmaI.
2. Проводим разделение
в агарозном геле.
3. ДНК выделяем из геля и
4. Используем для лигирования с последовательностью целевого гена.