Методы разделения белковых смесей. Хроматография презентация

степени гидрофобности, специфическом взаимодействии с носителем
Электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия разделение по величине молекулярных масс
Изоэлектрофокусирование разделение по величине изоэлектрических точек
Двумерный электрофорез изоэлектрическая точка+молекулярная масса
Иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг) - визуализация детекция при помощи антител

и десорбции.

Неподвижная фаза – твердое вещество или иммобилизованная жидкость
Подвижная фаза (элюэнт) – жидкость или газ

аналита с неподвижной фазой;
назначение.

хроматографии. Анализируемую смесь вводят в поток элюента в виде импульса . В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы.
Фронтальная хроматография
Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов. Родственный метод — твердофазная экстракция (сорбционное концентрирование).
Вытеснительная хроматография
В колонку после подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из компонентов смеси. Образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ.

твердофазных смесей с использованием твердых сорбентов. В аналититческой химии используется для пробоподготовки. Целевое вещество для анализа (аналит) сорбируется из матрицы и вымывается растворителями (экстрагируется). ТФЭ сокращает время пробоподготовки, уменьшает расход растворителей и поднимает точность анализа.

другую матрицу.
Основные методы ТФЭ:
одностадийная очистка, когда все нежелательные компоненты пробы собираются на сорбенте, а аналит собирается
двухстадийная очистка и концентрирование, когда проба наносится на патрон вместе с нежелательнимы примесями, а потом с помощью более сильного элюента смывается аналит. Все нежелательные примеси остаются на сорбенте.
трехстадийная очистка и концентрирование: на первом этапе все компоненты наносятся на патрон, на втором смываются легкие нежелательные компоненты, на третьем смывается аналит. Все тяжелые нежелательные примеси остаются на сорбенте.

флюидная хроматография

поверхностью неподвижного носителя.
Подвижной фазой является жидкость (LLC — англ. liquid liquid chromatography), которая служит растворителем, или газ (газовая хроматография). Разделение происходит за счёт различия полярности разделяемых веществ.
Частным случаем распределительной хроматографии является обращённо-фазная хроматография.

разделяемых молекул.
Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменная хроматография используют как первый этап очистки белков.
Принцип ионообменной хроматографии
Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию:
Катионная ионообменная хроматография задерживает положительно заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно заряженные функциональные группы, например, фосфат (PO43−).
Анионная ионообменная хроматография задерживает отрицательно заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет положительно заряженные функциональные группы, например, +N(R)4.

— сорбировать примеси, находящиеся в подвижной фазе.
Эффективность разделения примесей пропорциональна их величинам адсорбции при условиях эксперимента.
Процесс взаимодействия может сопровождаться химическим взаимодействием примесей с неподвижной фазой, то есть хемосорбцией.

проникать в поры неподвижной фазы.
Первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры.
! при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

Разделение феррицианида калия и голубого декстрана (сефадекс G25)

Принцип разделения

Vc
Препаративное разделение: не более 8-10% Vc

Низкого давления
агароза,
декстран,
полиакриламид,
сефадекс,
сефакрил,
сефароза,
супердекс.

Высокого давления
полиметакрилат,
полистирол,
силикагель

Сорбенты

и разделения белков, основанный на их избират. взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем.
В кач-ве лигандов используют соед., взаимод. к-рых с разделяемыми в-вами основано на биол. ф-ции последних.

Что связывается с носителем?

Субстраты,
Ингибиторы
Коферменты
Антитела

Катионы металлов – метало-хелатная хроматография (рекомбинантные белки).

промышленная (тонны)

Horváth)

Один из эффективнейших методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии.

смеситель
Система инжекции (автосэмплер)
Колонка
Детектор
Коллектор фракций

смеситель, (5) насос высокого давления, (6) «инжекция», (6') «загрузка», (7) петля, (8) предколонка, (9) аналитическая колонка, (10) детектор (IR, UV), (11) устройство управления (компьютер), (12) резервуар для отходов или коллектор фракций.

смешиваемость

давлением
Градиентный смеситель – обеспечивает градиент концентрации растворителя

Режимы:
изократический
Состав ПФ не изменяется; градиентный смеситель не нужен
градиентный
Состав ПФ изменяется, увеличивая силу элюэнта;
требуется градиентный смеситель

- часть объема колонки, не занятая сорбентом.
Длина (высота) колонки, внутренний диаметр колонки, размер частиц сорбента, вид сорбента.

мало зависящей от наличия и состава элюента в колонке.

2. сорбент должен обладать достаточно развитой однородной поверхностью и узким фракционным составом частиц.

3. сорбент не должен вступать в необратимые химические взаимодействия как с компонентами элюента, так и с разделяемой пробой.

радиоактивности
масс-спектрометрический (МС, MS)

времена удерживания компонентов 1 и 2.
Высота пика, h - расстояние от максимума пика до его основания, измеренное вдоль оси отклика детектора.

Нулевая (базовая) линия хроматограммы - линия, соответствующая нулевой концентрации анализируемых веществ в элюате.
Шум - помехи, статистические флуктуации нулевой линии хроматограммы. Уровень шума складывается из статистических флуктуации всех параметров, принимающих участие в образовании сигнала детектора.
Дрейф нулевой линии - постепенное смещение регистрируемое на хроматограмме.
Хроматографический пик - участок хроматограммы, соответствующий площади ограниченной функцией хроматограммы в момент выхода определяемого вещества из колонки и базовой линией.
Основание пика - продолжение нулевой линии, соединяющее начало и конец хроматографического пика.

основанием. В первом приближении S = hWh

Ширина пика у основания, Wb - отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика.

Ширина пика на полувысоте, Wh- отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной параллельно основанию пика на середине его высоты.

пробы вещества. Объем удерживания определяют между точкой ввода пробы и точкой, при которой регистрируется максимум сигнала детектора.

Мертвый объем, VM - объем подвижной фазы между точкой ввода пробы и точкой ее обнаружения (кюветой детектора). Мертвый объем включает в себя свободный объем колонки, объемы устройства ввода пробы (дозатора), детектора, а также объемы коммуникаций между ними.

Приведенный объем удерживания, VR’ - объем удерживания вещества за вычетом мертвого объема:
VR' = VR - VM

хроматографе. Практически время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума соответствующего хроматографического пика.

Мертвое время, tM - время пребывания несорбируемого вещества в хроматографе. На практике мертвое время определяют от момента ввода пробы несорбируемого вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора.

Приведенное время удерживания, tR’ - абсолютное время удерживания за вычетом мертвого времени:
tR'= tR- tM.

неподвижной фазой в выбранных условиях для данного сорбата, способность к образованию узкой концентрационной зоны индивидуального компонента разделяемой смеси. Эффективность в численном выражении определяется значениями числа теоретических тарелок и высотой, эквивалентной теоретической тарелке.

Число теоретических тарелок, N - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая по параметрам удерживания выбранного вещества по формуле

N = 16(tR/Wb)2 = 5.545(tR/Wh)2,

где tR - время удерживания пика, Wb - ширина пика на его полувысоте, Wh - ширина пика у основания.

Высота, эквивалентная теоретической тарелке, H - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая как отношение длины колонки L к числу теоретических тарелок

H = L/N

теоретических тарелок на колонке данной длины к условной колонке длиной 1 м.

N=100N/L,

где L - длина колонки в см.

Приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке

H’=H/d,

где d - средний (эффективный) диаметр частиц сорбента (мкм), она также является характеристикой эффективности колонки. Вполне удовлетворительным принято считать колонки со значением H равным 3-3,5d. Очень хорошими считаются колонки с Н равным 2d.

Фактор удерживания (коэффициент емкости), k' - один из основополагающих параметров удерживания в жидкостной хроматографии, безразмерная величина, характеризующая удерживание вещества и равная отношению приведенного времени удерживания к мертвому времени
k’=t’R/t’M.

высотой теоретической тарелки. Эффективность колонки тем выше, чем уже ширина пика при том же времени удерживания. Эффективность колонки измеряется числом теоретических тарелок N. Чем выше эффективность, тем больше величина N, тем меньше расширение первоначально узкой концентрационной зоны по мере прохождения ее через колонку, а значит, уже пик на выходе из колонки.

способность к специфическим взаимодействиям подвижной и неподвижной фазы с молекулами сорбата, обладающими определенными структурными признаками, приводящая к разной скорости перемещения концентрационных зон индивидуальных компонентов. Количественно селективность выражается как:
безразмерная величина, равная отношению приведенного объема (времени) удерживания определенного вещества, взятого для сравнения (стандарта) и хроматографируемого в идентичных условиях
αR/cm = kR/kcm = tR'/tcm' = VR'/Vcm’

условия хроматографии интересующей экспериментатора смеси компонентов. Исходя из химической природы разделяемых компонентов, хроматографист должен выбрать подходящий состав растворителя (подвижную фазу) и соответствующий по химической природе сорбент. Определенное влияние на селективность имеют и такие термодинамические факторы, как температура и давление в колонке, изменяющие коэффициенты распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами.

линии, проведенной на высоте 10 % от основания пика, при ее пересечении с вертикалью, опущенной из вершины пика. При этом берется отношение "тыльного" отрезка к "фронтальному"

АS = B/A

Разрешение пиков, RS - расстояние между максимумами выбранных соседних пиков, деленное на полусумму их ширин у основания (выраженных в одних и тех же единицах измерения)

RS = 2(tR2- tR1) / (Wb1+Wb2)

Разрешение как параметр, характеризующий разделение пиков, увеличивается по мере возрастания селективности, отражаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пиков.

Экстраколоночное расширение пика (ЭКР) - размывание хроматографической зоны, происходящее в инжекторе, соединительных капиллярах, в ячейке детектора.

включает следующие узлы
Дегазатор подвижной фазы
Градиентный смеситель
Насос
Инжектор
Колонка
Детектор
Коллектор фракций