Презентация на тему Создание библиотек и подготовка матрицы

Содержание

Полная схема процесса
Слайды и текст этой презентации

Слайд 1«Агентство Химэксперт»
Создание библиотек и подготовка матрицы
Варианты приготовления

библиотеки для секвенирования (химия процесса, наборы Ion

Xpress™ Plus, Thermo Scientific® MuSeek™, Ion TrueMate™, Ion Total RNA-Seq).
Подготовка матрицы (эммульсионная ПЦР, химия процесса).
Устройство и работа систем пробоподготовки OneTouch2 ™ и Ion Chef ™
«Агентство Химэксперт» Создание библиотек и подготовка матрицы Варианты приготовления библиотеки для секвенирования

Слайд 2Полная схема процесса

Полная схема процесса

Слайд 3Создание библиотек
Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library)
Ion Xpress™

Plus Library Kit (Ферментативная фрагментация)
Thermo Scientific® MuSeek™

DNA Fragment Library Kit (Фрагментация с лигированием адапторов)
Библиотека ампликонов (Amplicon Library)
Ion Plus Fragment Library Kit
Ion Xpress™ Plus Library Kit
AmpliSeq™ библиотеки ДНК и РНК (AmpliSeq™ DNA and RNA Library)
Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0
Ion AmpliSeq™ RNA Library Kit
РНК (кДНК) библиотеки (RNA-Seq Library)
Ion Total RNA-Seq Kit v2
Библиотека «16S Metagenomics» (16S Metagenomics Library)
Ion 16S™ Metagenomics Kit
Ion Plus Fragment Library Kit
Target-Seq библиотеки (Target-Seq Library)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kits
Библиотека «спаренных концов» (Mate Pair Library)
Ion TrueMate™ Library Preparation
Создание библиотек Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library) 	Ion Xpress™ Plus Library Kit

Слайд 4Создание библиотек
Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library)
Ion Xpress™

Plus Library Kit (Ферментативная фрагментация)
Thermo Scientific® MuSeek™

DNA Fragment Library Kit (Фрагментация с лигированием адапторов)

Библиотека ампликонов (Amplicon Library)
Ion Plus Fragment Library Kit
Ion Xpress™ Plus Library Kit
AmpliSeq™ библиотеки ДНК и РНК (AmpliSeq™ DNA and RNA Library)
Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0
Ion AmpliSeq™ RNA Library Kit
РНК (кДНК) библиотеки (RNA-Seq Library)
Ion Total RNA-Seq Kit v2
Библиотека «16S Metagenomics» (16S Metagenomics Library)
Ion 16S™ Metagenomics Kit
Ion Plus Fragment Library Kit
Target-Seq библиотеки (Target-Seq Library)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kits
Библиотека «спаренных концов» (Mate Pair Library)
Ion TrueMate™ Library Preparation

Создание библиотек Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library) 	Ion Xpress™ Plus Library Kit

Слайд 5Pub. no. MAN0007210 Rev. 4.0 Date: 30

May 2013 Decision

Pub. no. MAN0007210 Rev. 4.0 Date: 30 May 2013 Decision

Слайд 6Создание библиотеки: Ion Xpress™ Plus Library Kit
Прост

в использовании, совместим с баркодами,

2 часа

работы

Ion Shear® - ферментативная фрагментация ДНК

Необходимо 50-100 нг либо 1 мкг ДНК
Создание библиотеки: Ion Xpress™ Plus Library Kit Прост в использовании, совместим с

Слайд 7Фрагментирование ДНК при помощи комплекса транспозаз, присоединение

50 bp инвертированных повторов на оба конца,

затем ПЦР на адапторах для последующего секвенирования

Преимущество метода - в сочетании фрагментации с лигированием адапторов
Время постановки сопоставимо с Ion Xpress™

Необходимо небольшое количество ДНК (50 нг)

Создание библиотеки: Thermo Scientific® MuSeek™ DNA Fragment Library Kit

75 кДа MuA транспозаза – белок бактериофага Mu. Формирует гомотетрамерный комплекс с двумя 50-bp двуцепочечными транспозонными последовательностями, содержащими сайт связывания с MuA.

Фрагментирование ДНК при помощи комплекса транспозаз, присоединение 50 bp инвертированных повторов на

Слайд 81–5 мкг гДНК для 3-kb вставок,
10–20

мкг гДНК для 10-kb вставок
Image Courtesy

http://senayoohoo.wordpress.com/

Создание библиотеки: Mate Pair Library Preparation for Scaffolding of Genomes

Секвенирование спаренных концов (Mate Pair Sequencing) позволяет секвенировать две последовательности, располагающиеся в геноме на расстоянии до 10 000 нуклеотидов друг от друга, как единое целое.

de novo секвенирование,
поиск мутаций,
корректная сборка генома

1–5 мкг гДНК для 3-kb вставок,  10–20 мкг гДНК для 10-kb

Слайд 9Создание библиотеки: Ion TrueMate™ Library Preparation Workflow
This

is a schematic summarizing Ion TrueMate™ Library

construction workflow and expected sequence context of resulting 400 bp fragments used for templating and Ion PGM™ sequencing.

10 reactions 

Создание библиотеки: Ion TrueMate™ Library Preparation Workflow This is a schematic summarizing

Слайд 10Ion TrueMate Kit’s True Pair Rates of

>95% give better assemblies
Key Performance Metrics:
Construction of

“true” mate-pair libraries
Demonstrated performance of 60% pairs at >95% true pair rate

Produces LMP libraries with 2-8 kb inserts at true-pair rates

gDNA input from 2-10ug total

<8 kb protocol does not require the use of agarose gels (“gel-free”)

Launched Q3 2014

Ion TrueMate Kit’s True Pair Rates of >95% give better assemblies Key

Слайд 11Long Mate Pairs Bridge Gaps in Sequencing

Data
contig
contig
contig
Frags
Mates

Long Mate Pairs Bridge Gaps in Sequencing Data contig contig contig Frags Mates

Слайд 12Ion AmpliSeq™ для приготовления библиотек
Смесь
праймеров
Ультра-мультиплексная

ПЦР
Удаление праймеров
Лигирование адаптеров
Нормализация библиотеки

Ion AmpliSeq™ для приготовления библиотек Смесь   праймеров Ультра-мультиплексная ПЦР Удаление

Слайд 13Набор Ion Total RNA-Seq Kit V2.0
Библиотека

за 6 часов
Единый набор для получения ориентированной

библиотеки кДНК для любых видов РНК

Рекомендации:

1–500 нг поли(А) РНК,
10–500 нг тотальной РНК без рРНК
Тотальная РНК высокого качества (RIN >7)

Ion Total RNA-Seq Kit v2 Publication Number 4476286 Revision E © 2013 Life Technologies Corporation

Может использоваться для анализа как коротких РНК, так и полного набора транскриптов в клетке (транскриптома).

Набор Ion Total RNA-Seq Kit V2.0  Библиотека за 6 часов Единый

Слайд 14Ligase-Enhanced Genome Detection (LEGenD)
Двуцепочечные гетеродуплексные РНК/ДНК-адаптеры специфично

присоединятся к 3’- и 5’-концам РНК за

одну реакцию лигирования

В реакцию вступает одна цепь адаптера, причем только с одним из концов молекулы

Направленное и одновременное присоединение адаптеров РНК-лигазой. LEGenD™ Ligase Mix – высокоэффективный фермент, специфически распознающий двуцепочечные молекулы.

кДНК синтезируется с отдельного праймера, комплиментарного 3’-адаптеру
Ligase-Enhanced Genome Detection (LEGenD) Двуцепочечные гетеродуплексные РНК/ДНК-адаптеры специфично присоединятся к 3’- и

Слайд 15OH
P
P
OH
NNNNNN
3’ DNA
adaptor
3’ ‘guide’ adaptor (3’ blocked)
12,14,16 nts
Единый

набор для получения ориентированной библиотеки кДНК для

любых видов РНК
OH P P OH NNNNNN 3’ DNA adaptor 3’ ‘guide’ adaptor (3’

Слайд 16H2O
+
Reagent mix
+
Ion Sphere™ Particles
+
ДНК
+
Реакционное масло

DNA
A
Sequencing
D
Template Prep
C
Compatible Library Prep
B
Compatible FASTQ

Data
E
Приготовление матрицы

H2O + Reagent mix + Ion Sphere™ Particles + ДНК + Реакционное

Слайд 17+
ePCR Primers
B-P1
Что проиходит в каждой капле?
A
Biotin
Ion Spheres

+ ePCR Primers B-P1 Что проиходит в каждой капле? A Biotin Ion Spheres

Слайд 18A
P1’
P1
A’
Ion Spheres
ePCR Primers
B-P1
Денатурация
A
Biotin

A P1’ P1 A’ Ion Spheres ePCR Primers B-P1 Денатурация A Biotin

Слайд 19A
Biotin
P1’
A
B-P1
Отжиг праймера B-P1 на P1’

A Biotin P1’ A B-P1 Отжиг праймера B-P1 на P1’

Слайд 20A
Biotin
Достраивание праймера
P1’
A
B-P1

A Biotin Достраивание праймера P1’ A B-P1

Слайд 21A
Biotin
A’
Получен фрагмент (B-P1-Template-A’)
P1’
A
B-P1

A Biotin A’ Получен фрагмент (B-P1-Template-A’)  P1’ A B-P1

Слайд 22P1’
A
B-P1
A
Biotin
A’
Денатурация

P1’ A B-P1 A Biotin A’ Денатурация

Слайд 23B-P1
A
Biotin
A’
Биотинилированный праймер A отжигается на

адапторе A’
B-P1 A Biotin A’ Биотинилированный праймер A отжигается на

Слайд 24B-P1
A
Biotin
Достраивание праймера
A’

B-P1 A Biotin Достраивание праймера A’

Слайд 25B-P1
Biotin
B’-P1’
Получен фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin)
A’
A

B-P1 Biotin B’-P1’ Получен фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin)  A’ A

Слайд 26B-P1
A’
Денатурация
Biotin
B’-P1’
A

B-P1 A’ Денатурация  Biotin B’-P1’ A

Слайд 27B
Ion Sphere covered in B primers
Денатурация
Biotin
B’-P1’
A

B Ion Sphere covered in B primers Денатурация Biotin B’-P1’ A

Слайд 28B
Ion Sphere covered in B primers
Фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin)

отжигается

на праймер B, связанный со сферой Ion Spheres

Biotin

B’-P1’

A

B Ion Sphere covered in B primers Фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin) отжигается

Слайд 29Ion Sphere covered in B primers
Достраивание праймера
B
Biotin
B’-P1’
A

Ion Sphere covered in B primers Достраивание праймера B Biotin B’-P1’ A

Слайд 30Ion Sphere covered in B primers
Достраивание праймера
B
Biotin
B’-P1’
A

Ion Sphere covered in B primers Достраивание праймера B Biotin B’-P1’ A

Слайд 31Ion Sphere covered in B primers
A’
Фрагмент (B-P1-Template-A’)

связан со сферой
B
Biotin
B’-P1’
A

Ion Sphere covered in B primers A’ Фрагмент (B-P1-Template-A’) связан со сферой

Слайд 32Ion Sphere covered in B extended primers
B-P1
Ion

Spheres покрываются клонально
амплифицированным фрагментом (B-P1-template-A’)


A’

Biotin

B’-P1’

A

Ion Sphere covered in B extended primers B-P1 Ion Spheres покрываются клонально

Слайд 33Устройство OneTouch 2

Устройство OneTouch 2

Слайд 34Система Ion OneTouch™ 2 System OneTouch™ 2

Instrument и Enrichment System
Простая в использовании, настольная

система, позволяющая автоматизировать создание субстрата (матрицы)
Минуты ручной работы
Интегрированы элемент Пельтье для термоциклирования, насос, а также сменная одноразовая линия провода образца
Поддержка матриц длиной в 200-400 п.н. для секвенировании на Ion PGM™
Поддержка матриц длиной в 200 п.н. для секвенировании на Ion Proton™

Система Ion OneTouch™ 2 System 
 OneTouch™ 2 Instrument и Enrichment System

Слайд 35Простой автоматизированный рабочий процесс
OneTouch Instrument
OneTouch ES

Простой автоматизированный рабочий процесс OneTouch Instrument OneTouch ES

Слайд 36Устройство системы OneTouch

Устройство системы OneTouch

Слайд 38OneTouch в разобранном виде

OneTouch в разобранном виде

Слайд 39OneTouch в разобранном виде

OneTouch в разобранном виде

Слайд 40OneTouch. Ход рабочего процесса.

OneTouch. Ход рабочего процесса.

Слайд 41OneTouch. Внешний вид расходных материалов.

OneTouch. Внешний вид расходных материалов.

Слайд 42OneTouch. Вид центрифуги сверху (с открытой крышкой)

OneTouch. Вид центрифуги сверху (с открытой крышкой)

Слайд 43Приготовление матрицы
Confidential and Proprietary -- Do Not

Duplicate
Продукты эмульсионной ПЦР:
Моноклональные ISPs
Поликлональные ISPs
Пустые сферы

DNA
A
Sequencing
D
Template

Prep

C

Compatible Library Prep

B

Compatible FASTQ Data

E

Приготовление матрицы Confidential and Proprietary -- Do Not Duplicate Продукты эмульсионной ПЦР:

Слайд 44Подготовка матрицы
По окончании процесса проводится сбор всех

ионосфер:
1. Моноклональные ISPs
2. Поликлональные ISPs
3. Пустые ISPs

Подготовка матрицы По окончании процесса проводится сбор всех ионосфер: 1. Моноклональные ISPs

Слайд 45Проверка качества приготовления матрицы
Кат.ном.: 4468656 - Ion Sphere™ Quality

Control Kit
(20 quality control measurements)

Проверка качества приготовления матрицы Кат.ном.:	4468656	- Ion Sphere™ Quality Control Kit 		 (20 quality control measurements)

Слайд 46Проверка качества матрицы. Рабочий процесс.

Проверка качества матрицы. Рабочий процесс.

Слайд 47Механизм процедуры обогащения

Механизм процедуры обогащения

Слайд 48Смысл процедуры обогащения
По окончании процедуры обогащения собираются

все ионосферы, несущие матрицу:
1. Моноклональные
2. Поликлональные

(пустые сферы

удаляются)
Смысл процедуры обогащения По окончании процедуры обогащения собираются все ионосферы, несущие матрицу:

Слайд 49Опции после проведения сбора матрицы

Опции после проведения сбора матрицы

Слайд 50Устройство OneTouch ES

Устройство OneTouch ES

Слайд 51Автоматизированная технология обогащения
Биотинилированная матрица на ISP
Частицы MyOne

со стрептавидином
ISP без матрицы

Автоматизированная технология обогащения Биотинилированная матрица на ISP Частицы MyOne со стрептавидином ISP без матрицы

Слайд 52Суммирование хода рабочего процесса при использовании OneTouch
Biotinylated

Template + ISP
MyOne Bead + Streptavidin
Non-Templated ISP

Суммирование хода рабочего процесса при использовании OneTouch Biotinylated Template + ISP MyOne

Слайд 53Ion Chef™
«Агентство Химэксперт»
Next-generation sequencing

Ion Chef™ «Агентство Химэксперт» Next-generation sequencing

Слайд 54Система Ion Chef™ Полностью автоматизированная пробоподготовка на единой

платформе
15 минут ручной работы
Увеличивает воспроизводимость

Экономит рабочее время

и усилия

Готовит чипы для систем Ion PGM™
и Ion Proton™

Эмульсификация, амплификация, отмывка микросфер с ДНК, обогащение, загрузка чипов.

Система Ion Chef™
 Полностью автоматизированная пробоподготовка на единой платформе 15 минут ручной

Слайд 55Настольная система Ion Chef Автоматизации приготовления матрицы и

загрузки на чип
25 in / 63.5 cm
Наконечники
Загрузчик
чипов
Модуль

для
промывки

Термо-
циклер

Холодильник
для реактивов

25 in / 63.5 cm

22 in / 55.9 cm

Обогощение

Настольная система Ion Chef
 Автоматизации приготовления матрицы и загрузки на чип 25

Слайд 56Solution Cartridge Ambient Station
Reagent Cartridge Cold Station
New

tip rack
Used tip rack.
Enrichment module
Tube

centrifuges for ISP recovery and washing

Thermal cycler

Рабочий стол

Thermal cycler lid

Chip centrifuge

Solution Cartridge Ambient Station Reagent Cartridge Cold Station New tip rack

Слайд 57Перед запуском системы Ion Chef
Трэкинг образцов и

проверка перед запуском:
Система Microscan Vision (камера и

сканер баркодов)

Возможность трэкинга образцов
Чипы с баркодами, образцы библиотек

Проверка запуска
Скан всех блоков для проверки правильности настроек


Перед запуском системы Ion Chef Трэкинг образцов и проверка перед запуском: Система

Слайд 58Очистка после запуска

Удаление загруженных чипов

Удаление пластика

Камера Microscan™

сканирует поверхность после очистки

UV-освещение между запусками для

устранения опасности контаминации

Очистка после запуска  Удаление загруженных чипов  Удаление пластика  Камера

Слайд 59Сконструирован для поддержки чистоты внутри
Ламинарный поток для

изоляции «грязных» и «чистых» зон
Одноразовые расходные материалы
Запечатанные

плашки для амплификации и закрытые картриджи и центрифуга (для удержания аэрозолей)
UV-радиация для деконтаминации
Сконструирован для поддержки чистоты внутри Ламинарный поток для изоляции «грязных» и «чистых»

Слайд 60Привычный графический интерфейс
Основанный на интерфейсе систем PGM™,

Proton™ и OneTouch2™

Привычный графический интерфейс Основанный на интерфейсе систем PGM™, Proton™ и OneTouch2™

Слайд 61Ion Chef™: приготовление библиотек и нанесение на

чип

Ion Chef™: 
 приготовление библиотек и нанесение на чип

Слайд 70Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380

B2)
Disclosed are methods for nucleic acid amplification

wherein nucleic acid templates, beads, and amplification reaction solution are emulsified and the nucleic acid templates are amplified to provide clonal copies of the nucleic acid templates attached to the beads. Also disclosed are kits and apparatuses for performing the methods of the invention.

FIG. 1 Schematic of the structure of a DNA capture bead

http://www.google.com/patents/US8765380

Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380 B2) Disclosed are methods for

Слайд 71Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380

B2)
The following experiment was performed to test

the efficacy of the bead emulsion PCR. For this protocol, 600,000 Sepharose beads, with an average diameter of 25-35 μm (as supplied my the manufacturer) were covalently attached to capture primers at a ratio of 30-50 million copies per bead. The beads with covalently attached capture primers were mixed with 1.2 million copies of single stranded Adenovirus Library. The library constructs included a sequence that was complimentary to the capture primer on the beads.

FIG. 1 Schematic of the structure of a DNA capture bead

http://www.google.com/patents/US8765380

Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380 B2) The following experiment was

Слайд 72Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380

B2)
FIGS. 8A-8C Schematic showing the initial stages of

bead emulsion amplification used in conjunction with double ended sequencing. The NHS-activated bead (FIG. 8A) is attached with capture primers (FIG. 8B), and encapsulated in a microreactor comprising the DNA capture bead and template (FIG. 8C).
Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380 B2) FIGS. 8A-8C Schematic showing the

Слайд 73Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380

B2)
FIG. 9 Schematic showing the amplification and capture

stages of bead emulsion amplification used in conjunction with double ended sequencing. The template is amplified by solution phase PCR and the amplification products are attached to the DNA capture bead.
Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380 B2) FIG. 9 Schematic showing the

Слайд 74Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380

B2)
FIG. 10 Schematic showing the later stages of

bead emulsion amplification used in conjunction with double ended sequencing. The emulsion is broken down (FIGS. 10A-10B), the second strand of the amplification product is removed and enrichment is used to maximize the number of beads bound with amplification product (FIG. 10C), the sequencing primers are annealed (FIG. 10D), and the first strand is sequenced (FIG. 10E), followed by the second strand.
Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380 B2) FIG. 10 Schematic showing the

Слайд 75CMOS:

http://www.google.com/patents/US20140264660

http://pdfaiw.uspto.gov/.aiw?docid=20140264660&PageNum=1&&IDKey=3DB835E9F4FC&HomeUrl=http://appft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1%2526Sect2=HITOFF%2526d=PG01%2526p=1%2526u=/netahtml/PTO/srchnum.html%2526r=1%2526f=G%2526l=50%2526s1=20140264660.PGNR.%2526OS=%2526RS=

http://www.google.com/patents/US20140217478

CMOS:  http://www.google.com/patents/US20140264660  http://pdfaiw.uspto.gov/.aiw?docid=20140264660&PageNum=1&&IDKey=3DB835E9F4FC&HomeUrl=http://appft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1%2526Sect2=HITOFF%2526d=PG01%2526p=1%2526u=/netahtml/PTO/srchnum.html%2526r=1%2526f=G%2526l=50%2526s1=20140264660.PGNR.%2526OS=%2526RS=  http://www.google.com/patents/US20140217478

Слайд 76Прибор:



https://www.google.com/patents/WO2010138188A1?cl=en&dq=inassignee:%22Ion+Torrent+Systems+Incorporated%22&hl=en&sa=X&ei=CegrVLOMBKa_ygPog4LADw&ved=0CBwQ6AEwADgK

http://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/originalDocument;jsessionid=F5959A1958F32E2A712C1E25EBC3D03D.espacenet_levelx_prod_0?CC=WO&NR=2010138188A1&KC=A1&FT=D&ND=&date=20101202&DB=&&locale=en_EP

Прибор:    https://www.google.com/patents/WO2010138188A1?cl=en&dq=inassignee:%22Ion+Torrent+Systems+Incorporated%22&hl=en&sa=X&ei=CegrVLOMBKa_ygPog4LADw&ved=0CBwQ6AEwADgK  http://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/originalDocument;jsessionid=F5959A1958F32E2A712C1E25EBC3D03D.espacenet_levelx_prod_0?CC=WO&NR=2010138188A1&KC=A1&FT=D&ND=&date=20101202&DB=&&locale=en_EP

Слайд 77System and Methods for Making and Processing

Emulsions
(US 20120258516 A1)
https://www.google.com/patents/US20120258516?dq=Bead+emulsion+nucleic+acid+OneTouch&hl=en&sa=X&ei=y-0rVJeJK8fXyQPOjoCIBA&ved=0CCYQ6AEwAQ

System and Methods for Making and Processing Emulsions (US 20120258516 A1) https://www.google.com/patents/US20120258516?dq=Bead+emulsion+nucleic+acid+OneTouch&hl=en&sa=X&ei=y-0rVJeJK8fXyQPOjoCIBA&ved=0CCYQ6AEwAQ

Слайд 78Methods and compositions for multiplex PCR
https://www.google.com/patents/US20130059762?dq=inassignee:%22Life+Technologies+Corporation%22+AmpliSeq&hl=en&sa=X&ei=OvYrVJD7EoKhyAPT94DoBg&ved=0CEAQ6AEwBQ

Methods and compositions for multiplex PCR https://www.google.com/patents/US20130059762?dq=inassignee:%22Life+Technologies+Corporation%22+AmpliSeq&hl=en&sa=X&ei=OvYrVJD7EoKhyAPT94DoBg&ved=0CEAQ6AEwBQ

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое ThePresentation.ru?

Это сайт презентаций, докладов, проектов, шаблонов в формате PowerPoint. Мы помогаем школьникам, студентам, учителям, преподавателям хранить и обмениваться учебными материалами с другими пользователями.


Для правообладателей

Яндекс.Метрика