Слайд 1«Агентство Химэксперт»
Создание библиотек и подготовка матрицы
Варианты приготовления
библиотеки для секвенирования (химия процесса, наборы Ion
Xpress™ Plus, Thermo Scientific® MuSeek™, Ion TrueMate™, Ion Total RNA-Seq).
Подготовка матрицы (эммульсионная ПЦР, химия процесса).
Устройство и работа систем пробоподготовки OneTouch2 ™ и Ion Chef ™
Слайд 3Создание библиотек
Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library)
Ion Xpress™
Plus Library Kit (Ферментативная фрагментация)
Thermo Scientific® MuSeek™
DNA Fragment Library Kit (Фрагментация с лигированием адапторов)
Библиотека ампликонов (Amplicon Library)
Ion Plus Fragment Library Kit
Ion Xpress™ Plus Library Kit
AmpliSeq™ библиотеки ДНК и РНК (AmpliSeq™ DNA and RNA Library)
Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0
Ion AmpliSeq™ RNA Library Kit
РНК (кДНК) библиотеки (RNA-Seq Library)
Ion Total RNA-Seq Kit v2
Библиотека «16S Metagenomics» (16S Metagenomics Library)
Ion 16S™ Metagenomics Kit
Ion Plus Fragment Library Kit
Target-Seq библиотеки (Target-Seq Library)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kits
Библиотека «спаренных концов» (Mate Pair Library)
Ion TrueMate™ Library Preparation
Слайд 4Создание библиотек
Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library)
Ion Xpress™
Plus Library Kit (Ферментативная фрагментация)
Thermo Scientific® MuSeek™
DNA Fragment Library Kit (Фрагментация с лигированием адапторов)
Библиотека ампликонов (Amplicon Library)
Ion Plus Fragment Library Kit
Ion Xpress™ Plus Library Kit
AmpliSeq™ библиотеки ДНК и РНК (AmpliSeq™ DNA and RNA Library)
Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0
Ion AmpliSeq™ RNA Library Kit
РНК (кДНК) библиотеки (RNA-Seq Library)
Ion Total RNA-Seq Kit v2
Библиотека «16S Metagenomics» (16S Metagenomics Library)
Ion 16S™ Metagenomics Kit
Ion Plus Fragment Library Kit
Target-Seq библиотеки (Target-Seq Library)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kits
Библиотека «спаренных концов» (Mate Pair Library)
Ion TrueMate™ Library Preparation
Слайд 5Pub. no. MAN0007210 Rev. 4.0 Date: 30
May 2013 Decision
Слайд 6Создание библиотеки: Ion Xpress™ Plus Library Kit
Прост
в использовании, совместим с баркодами,
2 часа
работы
Ion Shear® - ферментативная фрагментация ДНК
Необходимо 50-100 нг либо 1 мкг ДНК
Слайд 7Фрагментирование ДНК при помощи комплекса транспозаз, присоединение
50 bp инвертированных повторов на оба конца,
затем ПЦР на адапторах для последующего секвенирования
Преимущество метода - в сочетании фрагментации с лигированием адапторов
Время постановки сопоставимо с Ion Xpress™
Необходимо небольшое количество ДНК (50 нг)
Создание библиотеки: Thermo Scientific® MuSeek™ DNA Fragment Library Kit
75 кДа MuA транспозаза – белок бактериофага Mu. Формирует гомотетрамерный комплекс с двумя 50-bp двуцепочечными транспозонными последовательностями, содержащими сайт связывания с MuA.
Слайд 81–5 мкг гДНК для 3-kb вставок,
10–20
мкг гДНК для 10-kb вставок
Image Courtesy
http://senayoohoo.wordpress.com/
Создание библиотеки: Mate Pair Library Preparation for Scaffolding of Genomes
Секвенирование спаренных концов (Mate Pair Sequencing) позволяет секвенировать две последовательности, располагающиеся в геноме на расстоянии до 10 000 нуклеотидов друг от друга, как единое целое.
de novo секвенирование,
поиск мутаций,
корректная сборка генома
Слайд 9Создание библиотеки: Ion TrueMate™ Library Preparation Workflow
This
is a schematic summarizing Ion TrueMate™ Library
construction workflow and expected sequence context of resulting 400 bp fragments used for templating and Ion PGM™ sequencing.
10 reactions
Слайд 10Ion TrueMate Kit’s True Pair Rates of
>95% give better assemblies
Key Performance Metrics:
Construction of
“true” mate-pair libraries
Demonstrated performance of 60% pairs at >95% true pair rate
Produces LMP libraries with 2-8 kb inserts at true-pair rates
gDNA input from 2-10ug total
<8 kb protocol does not require the use of agarose gels (“gel-free”)
Launched Q3 2014
Слайд 11Long Mate Pairs Bridge Gaps in Sequencing
Data
contig
contig
contig
Frags
Mates
Слайд 12Ion AmpliSeq™ для приготовления библиотек
Смесь
праймеров
Ультра-мультиплексная
ПЦР
Удаление праймеров
Лигирование адаптеров
Нормализация библиотеки
Слайд 13Набор Ion Total RNA-Seq Kit V2.0
Библиотека
за 6 часов
Единый набор для получения ориентированной
библиотеки кДНК для любых видов РНК
Рекомендации:
1–500 нг поли(А) РНК,
10–500 нг тотальной РНК без рРНК
Тотальная РНК высокого качества (RIN >7)
Ion Total RNA-Seq Kit v2 Publication Number 4476286 Revision E © 2013 Life Technologies Corporation
Может использоваться для анализа как коротких РНК, так и полного набора транскриптов в клетке (транскриптома).
Слайд 14Ligase-Enhanced Genome Detection (LEGenD)
Двуцепочечные гетеродуплексные РНК/ДНК-адаптеры специфично
присоединятся к 3’- и 5’-концам РНК за
одну реакцию лигирования
В реакцию вступает одна цепь адаптера, причем только с одним из концов молекулы
Направленное и одновременное присоединение адаптеров РНК-лигазой. LEGenD™ Ligase Mix – высокоэффективный фермент, специфически распознающий двуцепочечные молекулы.
кДНК синтезируется с отдельного праймера, комплиментарного 3’-адаптеру
Слайд 15OH
P
P
OH
NNNNNN
3’ DNA
adaptor
3’ ‘guide’ adaptor (3’ blocked)
12,14,16 nts
Единый
набор для получения ориентированной библиотеки кДНК для
любых видов РНК
Слайд 16H2O
+
Reagent mix
+
Ion Sphere™ Particles
+
ДНК
+
Реакционное масло
DNA
A
Sequencing
D
Template Prep
C
Compatible
Library Prep
B
Compatible
FASTQ
Data
E
Приготовление матрицы
Слайд 17+
ePCR Primers
B-P1
Что проиходит в каждой капле?
A
Biotin
Ion Spheres
Слайд 18A
P1’
P1
A’
Ion Spheres
ePCR Primers
B-P1
Денатурация
A
Biotin
Слайд 19A
Biotin
P1’
A
B-P1
Отжиг праймера B-P1 на P1’
Слайд 20A
Biotin
Достраивание праймера
P1’
A
B-P1
Слайд 21A
Biotin
A’
Получен фрагмент (B-P1-Template-A’)
P1’
A
B-P1
Слайд 23B-P1
A
Biotin
A’
Биотинилированный праймер A отжигается на
адапторе A’
Слайд 24B-P1
A
Biotin
Достраивание праймера
A’
Слайд 25B-P1
Biotin
B’-P1’
Получен фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin)
A’
A
Слайд 27B
Ion Sphere covered in B primers
Денатурация
Biotin
B’-P1’
A
Слайд 28B
Ion Sphere covered in B primers
Фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin)
отжигается
на праймер B, связанный со сферой Ion Spheres
Biotin
B’-P1’
A
Слайд 29Ion Sphere covered in B primers
Достраивание праймера
B
Biotin
B’-P1’
A
Слайд 30Ion Sphere covered in B primers
Достраивание праймера
B
Biotin
B’-P1’
A
Слайд 31Ion Sphere covered in B primers
A’
Фрагмент (B-P1-Template-A’)
связан со сферой
B
Biotin
B’-P1’
A
Слайд 32Ion Sphere covered in B extended primers
B-P1
Ion
Spheres покрываются клонально
амплифицированным фрагментом (B-P1-template-A’)
A’
Biotin
B’-P1’
A
Слайд 34Система Ion OneTouch™ 2 System
OneTouch™ 2
Instrument и Enrichment System
Простая в использовании, настольная
система, позволяющая автоматизировать создание субстрата (матрицы)
Минуты ручной работы
Интегрированы элемент Пельтье для термоциклирования, насос, а также сменная одноразовая линия провода образца
Поддержка матриц длиной в 200-400 п.н. для секвенировании на Ion PGM™
Поддержка матриц длиной в 200 п.н. для секвенировании на Ion Proton™
Слайд 35Простой автоматизированный рабочий процесс
OneTouch Instrument
OneTouch ES
Слайд 40OneTouch. Ход рабочего процесса.
Слайд 41OneTouch. Внешний вид расходных материалов.
Слайд 42OneTouch. Вид центрифуги сверху (с открытой крышкой)
Слайд 43Приготовление матрицы
Confidential and Proprietary -- Do Not
Duplicate
Продукты эмульсионной ПЦР:
Моноклональные ISPs
Поликлональные ISPs
Пустые сферы
DNA
A
Sequencing
D
Template
Prep
C
Compatible
Library Prep
B
Compatible
FASTQ Data
E
Слайд 44Подготовка матрицы
По окончании процесса проводится сбор всех
ионосфер:
1. Моноклональные ISPs
2. Поликлональные ISPs
3. Пустые ISPs
Слайд 45Проверка качества приготовления матрицы
Кат.ном.: 4468656 - Ion Sphere™ Quality
Control Kit
(20 quality control measurements)
Слайд 46Проверка качества матрицы. Рабочий процесс.
Слайд 48Смысл процедуры обогащения
По окончании процедуры обогащения собираются
все ионосферы, несущие матрицу:
1. Моноклональные
2. Поликлональные
(пустые сферы
удаляются)
Слайд 49Опции после проведения сбора матрицы
Слайд 51Автоматизированная технология обогащения
Биотинилированная матрица на ISP
Частицы MyOne
со стрептавидином
ISP без матрицы
Слайд 52Суммирование хода рабочего процесса при использовании OneTouch
Biotinylated
Template + ISP
MyOne Bead + Streptavidin
Non-Templated ISP
Слайд 53Ion Chef™
«Агентство Химэксперт»
Next-generation sequencing
Слайд 54Система Ion Chef™
Полностью автоматизированная пробоподготовка на единой
платформе
15 минут ручной работы
Увеличивает воспроизводимость
Экономит рабочее время
и усилия
Готовит чипы для систем Ion PGM™
и Ion Proton™
Эмульсификация, амплификация, отмывка микросфер с ДНК, обогащение, загрузка чипов.
Слайд 55Настольная система Ion Chef
Автоматизации приготовления матрицы и
загрузки на чип
25 in / 63.5 cm
Наконечники
Загрузчик
чипов
Модуль
для
промывки
Термо-
циклер
Холодильник
для реактивов
25 in / 63.5 cm
22 in / 55.9 cm
Обогощение
Слайд 56Solution Cartridge Ambient Station
Reagent Cartridge Cold Station
New
tip rack
Used tip rack.
Enrichment module
Tube
centrifuges for ISP recovery and washing
Thermal cycler
Рабочий стол
Thermal cycler lid
Chip centrifuge
Слайд 57Перед запуском системы Ion Chef
Трэкинг образцов и
проверка перед запуском:
Система Microscan Vision (камера и
сканер баркодов)
Возможность трэкинга образцов
Чипы с баркодами, образцы библиотек
Проверка запуска
Скан всех блоков для проверки правильности настроек
Слайд 58Очистка после запуска
Удаление загруженных чипов
Удаление пластика
Камера Microscan™
сканирует поверхность после очистки
UV-освещение между запусками для
устранения опасности контаминации
Слайд 59Сконструирован для поддержки чистоты внутри
Ламинарный поток для
изоляции «грязных» и «чистых» зон
Одноразовые расходные материалы
Запечатанные
плашки для амплификации и закрытые картриджи и центрифуга (для удержания аэрозолей)
UV-радиация для деконтаминации
Слайд 60Привычный графический интерфейс
Основанный на интерфейсе систем PGM™,
Proton™ и OneTouch2™
Слайд 61Ion Chef™:
приготовление библиотек и нанесение на
чип
Слайд 70Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380
B2)
Disclosed are methods for nucleic acid amplification
wherein nucleic acid templates, beads, and amplification reaction solution are emulsified and the nucleic acid templates are amplified to provide clonal copies of the nucleic acid templates attached to the beads. Also disclosed are kits and apparatuses for performing the methods of the invention.
FIG. 1 Schematic of the structure of a DNA capture bead
http://www.google.com/patents/US8765380
Слайд 71Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380
B2)
The following experiment was performed to test
the efficacy of the bead emulsion PCR. For this protocol, 600,000 Sepharose beads, with an average diameter of 25-35 μm (as supplied my the manufacturer) were covalently attached to capture primers at a ratio of 30-50 million copies per bead. The beads with covalently attached capture primers were mixed with 1.2 million copies of single stranded Adenovirus Library. The library constructs included a sequence that was complimentary to the capture primer on the beads.
FIG. 1 Schematic of the structure of a DNA capture bead
http://www.google.com/patents/US8765380
Слайд 72Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380
B2)
FIGS. 8A-8C Schematic showing the initial stages of
bead emulsion amplification used in conjunction with double ended sequencing. The NHS-activated bead (FIG. 8A) is attached with capture primers (FIG. 8B), and encapsulated in a microreactor comprising the DNA capture bead and template (FIG. 8C).
Слайд 73Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380
B2)
FIG. 9 Schematic showing the amplification and capture
stages of bead emulsion amplification used in conjunction with double ended sequencing. The template is amplified by solution phase PCR and the amplification products are attached to the DNA capture bead.
Слайд 74Bead emulsion nucleic acid amplification (US 8765380
B2)
FIG. 10 Schematic showing the later stages of
bead emulsion amplification used in conjunction with double ended sequencing. The emulsion is broken down (FIGS. 10A-10B), the second strand of the amplification product is removed and enrichment is used to maximize the number of beads bound with amplification product (FIG. 10C), the sequencing primers are annealed (FIG. 10D), and the first strand is sequenced (FIG. 10E), followed by the second strand.
Слайд 75CMOS:
http://www.google.com/patents/US20140264660
http://pdfaiw.uspto.gov/.aiw?docid=20140264660&PageNum=1&&IDKey=3DB835E9F4FC&HomeUrl=http://appft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1%2526Sect2=HITOFF%2526d=PG01%2526p=1%2526u=/netahtml/PTO/srchnum.html%2526r=1%2526f=G%2526l=50%2526s1=20140264660.PGNR.%2526OS=%2526RS=
http://www.google.com/patents/US20140217478
Слайд 76Прибор:
https://www.google.com/patents/WO2010138188A1?cl=en&dq=inassignee:%22Ion+Torrent+Systems+Incorporated%22&hl=en&sa=X&ei=CegrVLOMBKa_ygPog4LADw&ved=0CBwQ6AEwADgK
http://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/originalDocument;jsessionid=F5959A1958F32E2A712C1E25EBC3D03D.espacenet_levelx_prod_0?CC=WO&NR=2010138188A1&KC=A1&FT=D&ND=&date=20101202&DB=&&locale=en_EP
Слайд 77System and Methods for Making and Processing
Emulsions
(US 20120258516 A1)
https://www.google.com/patents/US20120258516?dq=Bead+emulsion+nucleic+acid+OneTouch&hl=en&sa=X&ei=y-0rVJeJK8fXyQPOjoCIBA&ved=0CCYQ6AEwAQ
Слайд 78Methods and compositions for multiplex PCR
https://www.google.com/patents/US20130059762?dq=inassignee:%22Life+Technologies+Corporation%22+AmpliSeq&hl=en&sa=X&ei=OvYrVJD7EoKhyAPT94DoBg&ved=0CEAQ6AEwBQ
