Презентация на тему Роль внеклеточного рН в регуляции Са2+-входа в лимфоцитах человека

Роль внеклеточного рН в регуляции Са2+-входа
в лимфоцитах человека

Работа выполнена в ИНЦ РАН в лаборатории
Ионных механизмов клеточной сигнализации

Выполнила: студентка гр.63417/1 Черезова А.Л.
Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. Семенова С.Б.

Санкт-Петербургский Политехнический Университет Петра Великого
Институт физики, нанотехнологий и телекоммуникаций
Кафедра биофизики

ВЫПУСКНАЯ РАБОТА МАГИСТРА:

Санкт-Петербург 2016

Кальциевые каналы в Т-клетках

Филогенетическое древо суперсемейства каналов TRP млекопитающих

Схема трансклеточного транспорта в почке и тонком кишечнике

Цель работы: Исследовать роль внеклеточного рН в регуляции активности кальциевых каналов в Т-клетках линии Jurkat.

Задачи:
C помощью метода patch-clamp исследовать влияние изменения внеклеточного рН на активность кальциевых каналов TRPV5/TRPV6 в плазматической мембране клеток Jurkat.
С помощью флуоресцентного кальциевого зонда Fura-2AM исследовать роль внеклеточного рН в регуляции внутриклеточной концентрации Са2+.
Исследовать роль внутриклеточного транспорта в регуляции активности каналов TRPV5/TRPV6 в клетках Jurkat.
Определить роль внутриклеточного транспорта в регуляции внутриклеточной концентрации Са2+.

Метод локальной фиксации потенциала, patch-clamp

Методы:

Метод флуоресцентного измерения внутриклеточной концентрации Са2+

Развитие активности каналов после образования whole-cell конфигурации. Поддерживаемый мембранный потенциал -70мВ.

Развитие интегральной активности каналов TRPV5/V6 в клетках Jurkat

А. Запись интегрального тока в режиме whole-cell. Уменьшение активности каналов при смене наружного раствора с рН=7,3 на раствор с рН=6. Поддерживаемый
потенциал -70мВ. Б. Соответствующие различным рН амплитудные гистограммы, описанные функцией Гаусса.

Изменение активности каналов TRPV5/V6 при понижении рН
наружного раствора

А. Запись интегрального тока в режиме whole-cell. Увеличение активности каналов при смене наружного раствора с рН=7,3 на раствор с рН=8,2. Поддерживаемый потенциал -70 мВ. Б. Амплитудные гистограммы токов, описанные функцией Гаусса.

Изменение активности каналов TRPV5/V6 при повышении рН
наружного раствора

Записи токов в режиме outside-out. Понижение рН раствора приводило к инактивации каналов. Этот эффект был необратим. Поддерживаемый
потенциал -70мВ.

Влияние снижения рН раствора на активность каналов TRPV5/V6
в клетках Jurkat

Записи токов одиночных каналов в конфигурации сell-attached. Замена экстраклеточного раствора с рН=7,3 на раствор с рН=6,0 (при нейтральном рН раствора в пипетке) приводила к инактивации каналов TRPV5/V6. Поддерживаемый потенциал на мембране -70мВ.

Действие рН на активность одиночных каналов TRPV5/V6
в клетках Jurkat

Влияние ингибитора внутриклеточного транспорта, дайносора, на активность TRPV5/V6

Запись интегрального тока в режиме whole-cell.
Уменьшение активности каналов после подачи 100мкМ дайносора.

Влияние внеклеточного рН на уровень внутриклеточного кальция
в клетках Jurkat

А. Измерения уровня внутриклеточной концентрации Са2+ с использованием Са2+-чувствительного зонда Fura-2АМ. Ацидификация наружного раствора приводила к уменьшению входа кальция в клетки Jurkat, защелачивание наружного раствора приводило к существенному увеличению входа кальция в клетки Jurkat.
Б. Гистограммы изменения концентрации внутриклеточного кальция при рН=7,3, рН=6, рН=8,2. *P<0,05 согласно t-тесту Стьюдента.

Влияние дайносора на уровень внутриклеточного кальция
в клетках Jurkat

А. Ингибитор эндо/экзоцитоза дайносор (100мкМ) блокирует вход Са2+ в клетки.
Б. Гистограммы изменения концентрации внутриклеточного кальция с дайносором и без. *P<0,05 согласно t-тесту Стьюдента.

Предполагаемая схема регуляции кальциевого входа
в Т-лимфоцитах человека

Изменение внеклеточного рН

Активация внутриклеточного транспорта и доставка каналов TRPV5/V6 на плазматическую мембрану клеток

Са2+-вход через каналы TRPV5/V6 в Т-клетки человека

Иммунный ответ Т-клеток

Изменение концентрации внутриклеточного Са2+

Активность каналов TRPV5/V6 в клетках Jurkat зависит от внеклеточного рН. Повышение рН увеличивает активность каналов, снижение рН уменьшает активность каналов.
2) Регуляция активности каналов внеклеточным рН, по-видимому, не связана с прямым воздействием на пору каналов TRPV5/V6.
3) Ингибитор динамин-зависимого эндоцитоза, дайносор блокирует активность каналов TRPV5/V6.
4) Вход кальция в клетки Jurkat регулируется внеклеточным рН. Повышение рН увеличивает уровень свободного Са2+, снижение рН уменьшает уровень свободного Са2+ в клетке.
5)Блокирование внутриклеточного транспорта ингибирует вход Са2+ в клетки Jurkat.
6) Внеклеточный рН участвует в регуляции активности каналов TRPV5/V6 и входе Са2+ в Т-клетки Jurkat, возможно, через воздействие на внутриклеточный транспорт.

Выводы:

1) Тезисы докладов и сообщений, представленных на
II Всероссийскую конференцию "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет". (Санкт-Петербург, 20-22 октября 2015г.) Роль внеклеточного рН в регуляции кальциевого входа в клетках Jurkat. А.Л. Черезова, В.Н. Томилин, Ю.А. Негуляев,
С.Б. Семёнова. ЦИТОЛОГИЯ 2015, Том 57, №9, стр.663.

2) Научная публикация в зарубежном рецензируемом журнале.
TRPV5/V6 Channels Mediate Ca2+ Influx in Jurkat T Cells Under the Control of Extracellular pH. Victor N. Tomilin, Alena L. Cherezova, Yuri A. Negulyaev and Svetlana B. Semenova. Journal of Cellular Biochemistry, 2016. 117(1):197–206.