Моторные белки презентация

Содержание

ОТКРЫТИЕ КИНЕЗИНА – НАЧАЛО НОВОЙ ЭРЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Marine Biological Laboratory Woods Hole, USA 1 мм выдавленная цитоплазма гигантский аксон кальмара Video-enhanced microscopy (differential interference contrast)

Слайд 1МОТОРНЫЕ БЕЛКИ

Слайд 2ОТКРЫТИЕ КИНЕЗИНА – НАЧАЛО НОВОЙ ЭРЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Marine Biological Laboratory
Woods Hole, USA
1

мм

выдавленная
цитоплазма

гигантский аксон
кальмара

Video-enhanced microscopy
(differential interference contrast)

1985

(Ron Vale’s homepage)

Robert Allen
Shinya Inoue

Слайд 3




Кинезины (Kinesins) и динеины (Dyneins) перемещаются по микротрубочкам
















кинезины
кинезин-14
динеины
ТРИ КЛАССА МЕХАНОХИМИЧЕСКИХ АТФаз

Миозины

(Myosins) перемещаются по актиновым филаментам















миозины

миозин VI


Слайд 4МИОЗИН II ИЗ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
шея
Coiled coil - хвост
Легкие цепи
Моторные головки
Область

антипараллельного
перекрывания хвостов

Миозиновые головки

150 нм

500 нм

2 нм

Тяжелые цепи ~200 кДа
Легкие цепи ~ 20 кДа

R-LC
E-LC

Слайд 5СЕМЕЙСТВО МИОЗИНОВ – 17 классов
Моторный домен
тип
миозина
структура
1000 аминокислотных остатков


Слайд 6МИОЗИН V
моторные домены
6 легких цепей
связывание
карго

Слайд 7МОЛЕКУЛА КИНЕЗИНА-1 - ГЕТЕРОТЕТРАМЕР
легкие цепи
~60 кДа
coiled coil стержень с изгибом
хвостовой

участок
тяжелой цепи

80 нм

тяжелые цепи
~120 кДа

моторные
головки

Слайд 9КИНЕЗИНЫ: ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА
кинезин-1

Моторный домен:
360 аминокислотных остатков
АТФазный центр
участок

связывания с
микротрубочкой

Кинезины, идентифицированные в мыши

(Hirokawa et al., 2009)

Coiled coil домен:
параллельная димеризация
разнесение в пространстве
моторного домена и участка
связывания карго

Хвостовой домен:
связывание аксессорных
субъединиц
взаимодействие с карго
регуляторные участки

кинезин-3

кинезин-2

кинезин -4

кинезин-13

кинезин-14



кинезин-3

кинезин-2


кинезин-4


Слайд 10МОТОРНЫЕ ДОМЕНЫ КИНЕЗИНА И МИОЗИНА
Нуклеотид-связывающий

карман

Моторный домен кинезина

Участок
связывания
актина

Участок связывания
легких цепей(рычаг)

Конверторный
домен

Моторный домен
миозина

Нуклеотид-связывающий
карман

по данным рентгено-структурного анализа

«Core» =180 аминокислот

6 ß-изгибов
3 х 2 α-спиралей

(Rayment et al., 1993,
Kull et al., 1996)

Слайд 11МЕХАНОХИМИЧЕСКИЙ ЦИКЛ
МЫШЕЧНОГО МИОЗИНА
Связывание АТФ – диссоциация от

актина

Гидролиз АТФ – подъем плеча рычага

Связывание с актином – освобождение фосфата

Освобождение фосфата - прочное связывание
с актином с последующим поворотом рычага

Освобождение АДФ – обмен на АТФ в связанном
с актином состоянии

активация полимерным актином
АТФазной активности = 200х

ATP

ADP+Pi

Pi

ADP

ATP

Слайд 12Ron Vale’s lab

Слайд 13МЕХАНОХИМИЧЕСКИЙ ЦИКЛ
КИНЕЗИНА-1
Связывание

АТФ – изменение взаимного
расположения моторного домена и шеи –
прочное связывание с микротрубочкой

Связывание с микротрубочкой – перемещение
задней головки вперед – фиксирование этой
головки на следующей β – субъединице тубулина
(на расстоянии 8 нм)

Гидролиз АТФ в задней головке – освобождение
АДФ и фосфата – диссоциация от микротрубочки

4. Обмен АДФ на АТФ в передней головке

активация АТФазной активности
микротрубочками = 5000х

ATP

ADP

ATP

ADP

ADP

ATP

ADP+Pi

ADP+Pi

ATP

Слайд 14(Ron Vale’s lab)

Слайд 15
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЙ ДИНЕИН: АТФаза ААА+
легкие цепи ~10-14 kDa
тяжелые цепи ~ 530 kDa
легкие

промежуточные цепи ~33-59 kDa

промежуточные цепи ~ 74 kDa

Тяжелая цепь цитоплазматического динеина

связывание с
микротрубочками

АТФазная
активность


1,2 млн Da

Слайд 16СЕМЕЙСТВО ДИНЕИНОВ
7 классов на основе выравнивания последовательностей тяжелых цепей


цитоплазма
эукариотических клеток



реснички и жгутики

(cytoplasmic dynein 1 and 2)

(axonemal dynein)

Класс I

Класс II

транспорт
цитоплазматических
грузов

транспорт внутри
жгутика и реснички
IFT


Слайд 17
реснички и жгутики

axonemal dyneins
Класс III
Класс IV
Класс V
Класс

VI

Класс VII

Outer arms dynein

Inner arms dynein

(Hook & Vallee, 2006)

α outer arm
dynein

β outer arm
dynein

γ outer arm
dynein

α inner arm
dynein

β inner arm
dynein

Слайд 18микротрубочка
моторный домен динеина
моторный домен кинезина-1
(Carter et al., 2011; Spudich, 2011)
РАЗМЕР

– НЕ ГЛАВНОЕ?

Слайд 19(Graham Johnson, Ron Vale’s lab)

Слайд 20СПОСОБЫ ИЗУЧЕНИЯ МОТОРНЫХ БЕЛКОВ
Электронная микроскопия отдельных молекул с напылением

металлом

Рентгеноструктурный анализ: трехмерная структура молекул

Криоэлектронная микроскопия: докинг моторных белков на треке

Атомно-силовая микроскопия: динамика взаимодействия мотора с треком

Генетические манипуляции: идентификация важных участков белковых цепей

In vitro motility assay + оптические ловушка и пинцет: измерение скоростей и сил


Слайд 21КАК РАБОТАЮТ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МОТОРЫ?
Происходит ли изменение конформации при гидролизе АТФ?
Как определяется

направление?
От чего зависит процессивность мотора?
Какова скорость движения мотора вдоль трека ?
Какую силу развивают моторные белки?
Шаги: как и на какое расстояние?
Траектория ?
------------------------------------------
Взаимодействие с треком?
Взаимодействие с карго?

Слайд 22МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ МИОЗИНА НА ФИЛАМЕНТЕ АКТИНА
Вращение участка S1, содержащего легкие

цепи, при диссоциации нуклеотида
(криоэлектронная микрофотография)

А – мономер актина
Mt – моторный домен
Е – essential легкая цепь
R – регуляторная легкая
цепь

(Whittaker et al., 1995)

в присутствии АДФ без нуклеотида

Смещение = 3.5 нм в
направлении минус-конца


S1

_

+

Слайд 23МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ КИНЕЗИНА НА МИКРОТРУБОЧКЕ
А – прикрепленная головка
F – свободная головка
(Arnal

& Wade, 1998)

Изменение взаимного расположения головок
димерного моторного домена кинезина-1
при связывании нуклеотида

без нуклеотида

AMP-PNP

Минимальный N-концевой
фрагмент тяжелой цепи,
способный димеризоваться

без нуклеотида

AMP-PNP

Слайд 24 АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
ATOMIC FORCE MICROSCOPY, AFM
принцип
устройство


лазер
образец
рычаг
пьезо-электрический

транслятор

детектор

поверхность

острие

Слайд 25 ПО СРАВНЕНИЮ С ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИЕЙ AFM:
имеет близкое и даже

большее разрешение

дает трехмерное изображение объекта

не требует фиксирования образца

работает в водной или воздушной среде

-----------------------------------------------------------------------------

маленькая площадь сканирования –
всего 150 х 150 мкм2 при глубине в несколько мкм

низкая скорость сканирования

Слайд 26Кинезин-1 на микротрубочке
in vitro в присутствии AMPPNP
Миозин V шагает по

актиновому
филаменту

ИЗОБРАЖЕНИЯ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

(из обзора Veigel & Schmidt, 2011)

Слайд 27 ПРОВЕРКА «ШЕИ» НА ПРОЧНОСТЬ
Coiled-coil
фрагмент
шейного участка
кинезина-1
кантилевер
AFM
фрагменты
филамина
Cys
Зависимость расплетания

супер-спирали
указывают на наличие определенного
энергитического барьера

(Bornschlogl et al., 2009)

расплетание
заплетание

cила натяжения (pN)

удлинение (нм)

«шея»

Слайд 28






Kin 14
Kin 1

полярность



1 13

327 338 975


1 хвост Coiled-coil stalk 329 349 700

моторный домен

Coiled-coil stalk хвост

моторный домен


шея

шея

НАПРАВЛЕННОСТЬ МОТОРА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ
НА ГРАНИЦЕ МОТОРНОГО ДОМЕНА И «ШЕИ»

13 326

ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК 1

194 348


ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК 2



13 326

194 346


(Endow & Waligora, 1998)

Слайд 29 IN VITRO MOTILITY ASSAY
Моторный белок сорбируется на стекло
Пластиковые микросферы

-

Quantum Dots

- Мембранные органеллы,
выделенные из клеток

Вариант 1

Вариант 2

Слайд 30 ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ ФИЛАМЕНТЫ АКТИНА
СКОЛЬЗЯТ ПО СТЕКЛУ, ПОКРЫТОМУ МИОЗИНОМ

Слайд 31дифференциальный
интерференционный
контраст

Слайд 32(Andrew Carter’s lab)

Слайд 33ПРОЦЕССИВНОСТЬ МОТОРНЫХ БЕЛКОВ
Плотность кинезина (мкм-2)
Плотность НММ (мкм -2)
Скорость (мкм/сек)
Скорость (мкм/сек)
Длина микротрубочки

2.5 мкм

Длина актинового
филамента 2 мкм

непроцессивные моторы
или «гребцы»

процессивные моторы
или «переносчики»

миозин II и его фрагмент НММ
асконемальный динеин

кинезин -1
миозин V
цитоплазматический динеин

Слайд 34 SINGLE MOLECULE FLUORESCENCE
Синтетические флуорохромы
Флуоресцирующие белки
Quantum Dots
микротрубочка

объектив
микроскопа
кинезин
возбужденный
флуорофор

Слайд 35(Ron Vale’s homepage)
Quantum Dots, покрытые динеином,
скользят

по микротрубочкам

Зеленый динеин и красный кинезин
скользят по аксонеме

(Andrew Carter’s lab)

Слайд 36СКОРОСТИ, РАЗВИВАЕМЫЕ РАЗНЫМИ МОТОРНЫМИ БЕЛКАМИ

Слайд 37производство и регистрация сил - в диапазоне pN
временное разрешение – миллисекунды
пространственное

разрешение – доли нанометра

покровное стекло

оптическая
ловушка

линза

СОЧЕТАНИЕ IN VITRO MOTILITY ASSAY С ОПТИЧЕСКОЙ ЛОВУШКОЙ

Слайд 38 КИНЕЗИН-1 НЕСЕТ МИКРОСФЕРУ ПО МИКРОТРУБОЧКЕ
Свободное движение
Движение в оптической ловушке
(S. Block’s

lab)

Слайд 39ВЛИЯНИЕ ПРИЛОЖЕННОЙ СИЛЫ НА ДВИЖЕНИЕ КИНЕЗИНА
сила (pN)
сила (pN)
положение (нм)
положение (нм)
30

сек

2 сек

кинезин с максимальной
нагрузкой генерирует силу
6 pN

работа при перемещении
на 8 нм равна 48 pN.nm

энергия гидролиза АТФ
составляет 100 pN

эффективность кинезина
50%!!!

Слайд 40 КИНЕЗИН В ОПТИЧЕСКОЙ ЛОВУШКЕ
время (сек)
положение (нм)
шаг кинезина-1 вдоль
микротрубочки =

8 нм

Под нагрузкой – в луче лазера –
движение шарика становится
прерывистым, так что можно
различить отдельные шаги.

Слайд 41(Hua et al., 2002)
Hand-over-hand
Inchworm

Слайд 42(Из обзора Yildiz et al., 2005)

Слайд 43 МИКРОТРУБОЧКИ, СОБРАННЫЕ ИЗ ЧИСТОГО ТУБУЛИНА IN VITRO,

МОГУТ СОДЕРЖАТЬ РАЗНОЕ ЧИСЛО ПРОТОФИЛАМЕНТОВ

12 13 14



Слайд 44 КИНЕЗИН ДВИЖЕТСЯ ПО ПРОТОФИЛАМЕНТУ
Опыт: скольжение микротрубочек по стеклу, покрытому кинезином-1
Время

(сек)

13

14

Слайд 46 ДИНЕИН МОЖЕТ МЕНЯТЬ ПРОТОФИЛАМЕНТ
(Reck-Peterson et al., 2006)
Смещение (нм)
Опыт: движение фрагмента

тяжелой цепи динеина по аксонеме

Время (сек)

Похожие презентации

Получение силикагеля, модифицированного бензоксазолами 280
Энергетический обмен, фотосинтез, хемосинтез 1220
Исследование: Развитие головастиков лягушки 390
Основные свойства жизни 541
Отдел Папоротникообразные 854
Влияние биоритмов на физическую работоспособность учащихся 384

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое ThePresentation.ru?

Это сайт презентаций, докладов, проектов, шаблонов в формате PowerPoint. Мы помогаем школьникам, студентам, учителям, преподавателям хранить и обмениваться учебными материалами с другими пользователями.

Для правообладателей

Яндекс.Метрика