Методы исследования уровня экспрессии генов презентация

РАН

Отмывка от несвязавшегося зонда

Результат авторадиографии

Гибридизация с радиоактивно меченым зондом

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)

образцов
Возможность оценить не только наличие, но и размер транскрипта (транскриптов)

Недостаточная чувствительность метода
Необходимы довольно большие количества суммарной РНК
Необходимость работать с радиоактивными изотопами.
Редкие и слабо представленные РНК не выявляются, что может приводить к ложноотрицательному результату.

мультиплексная ПЦР

Полуколичественные:
Конкурентная мультиплексная ПЦР
Анализ с помощью микрочипов

матрице мРНК

поли A хвост

3’

мРНК

oligo dT праймер

кДНК

Реакция обратной транскрипции

в хорошо
оптимизированных условиях– 1,6-1,4.

Преимущества метода

Проведение сравнительного анализа
Анализ экспрессии сразу большого количества генов
Теоретически возможно идентифицировать все неизвестные транскрипты
Низкая стоимость используемых реактивов

Недостатки метода

Получение качественных, а не количественных данных
Большая трудоёмкость метода
За счет конкуренции за dNTP и фермент не выявляются “редкие” малокопийные мРНК

оценки экспрессии генов. Используют две пары специфических праймеров в одной реакции. В качестве контроля выступают гены, экспрессия которых слабо меняется в условиях эксперимента.

Интенсивность полосы А

Интенсивность контрольной
полосы

Неконкурентная мультиплексная ПЦР

праймеров.

Конкурентная ДНК добавляется в реакции серией
заранее известных разведений

чувствительность метода
Чувствительность ферментов к загрязнениям и изменению условий

Низкая чувствительность метода детекции (окраска бромистым этидием).
Для фрагментов длиной менее 300 п.н. детектируемые количества продукта нарабатываются уже в районе перегиба, а не в линейной фазе реакции

Различия в эффективности амплификации фрагментов разной длины и разного нуклеотидного состава.
При разнице эффективности амплификации
двух фрагментов 5% изменение относительных концентраций уже на 25 цикле составит 3,6 раза.
При 10% - 14 раз
При 15% - 58 раз.

различия при статистической обработке результатов)
Метод достаточно дёшев, прост и быстр.
Возможно оценить экспрессию редких и слабо представленных мРНК
Требуется малое количество исходного материала

Главный недостаток – сильная подверженность влиянию «синдрома китайского студента».
Точность метода сильно зависит от квалификации и подготовки исследователя, что не является объективным критерием.
На точности метода сильно сказываются недостаточно чувствительные методы детекции

времени по флуоресценции возбуждаемого лазером красителя непосредственно в реакционной смеси.

Упрощённая модификация метода – использование интеркалирующего красителя SYBR-green.

Образование целевого продукта отслеживается при построении кривой плавления. Высокая чувствительность метода позволяет гарантированно снимать показания на линейной части кривой, до выхода реакции на плато.

гена
Возможен сравнительный анализ экспрессии нескольких (до 4) генов в одной пробе при использовании разных флуоресцентных красителей
Быстрота получения результата.

Недостатки метода

Сложности с выбором зондов
Высокие трудозатраты и цена

Недостатки метода

Сложности с выбором зондов
Цена

Комбинация ПЦР в реальном времени с Taqman-зондами
и эмульсионной ПЦР с одной молекулы

Преимущества метода

Самый точный
Очень чувствительный

короткими фрагментами ДНК

Олигонуклеотидные
На основе участков кДНК

генов
Наличие уже готовых панелей с различными целевыми наборами зондов.
Возможность автоматизации процедуры

Недостатки метода

Слабая воспроизводимость
Высокие уровни ошибок пере- и недопредсказания
Результаты необходимо перепроверять методом Real-time PCR
Исследуются только заказанные транскрипты

РНК
Разрезание первой рестриктазой
Лигирование с линкером, содержащим сайт Eco15I
Рестрикция ферментом Eco15I
Лигирование с образованием ди-тагов
Отрезание линкеров третьей рестриктазой
Лигирование в конкатемеры
Клонирование в бактериальный вектор
Секвенирование методом Сэнгера
Секвенирование на пиросеквенаторе Roche

Модификации метода – различаются по длине тага.
SAGE, LongSAGE, SuperSAGE

уровней транскрипции по сравнению с микрочиповыми технологиями
Возможность получения данных о неизвестных до того транскриптах

Недостатки:

Меньшая точность по сравнению с Real-Time PCR
Большая стоимость и трудоёмкость по сравнению с микрочипами

Достоинства SAGE

РНКазой III




Лигирование со специфическими адаптерами


Получение кДНК

Фракционирование

Амплификация библиотеки

Добавление внутренних контролей ERCC mix
Получение фракции мРНК и ribo-depleted RNA

эмульсии
Собственно секвенирование
Выравнивание и подсчёт копийности

без предварительных его исследований.
Возможность прямого сравнения экспрессии интересующих групп генов.
Идентификация групп генов, скоординированно меняющих свою экспрессию.
Наглядная классификация транскриптов по функциям и группам.
Обнаружение кластеров скоординированно меняющих экспрессию генов, не связанных общей функцией

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования

ходе пробоподготовки. Стандартный вариант – чтение с одного праймера, 50-75 п.н. – 40 млн. ридов. Позволяет идентифицировать экспрессию 80-85% генов При изучении альтернативного сплайсинга \ транскрипции – чтение с двух сторон по 75\150 п.н.
Поли-А РНК - чтение с одного праймера, 50-75 п.н. – 20 млн. ридов.
Транскриптом de novo – максимально длинные чтения, поли-А РНК, направленные библиотеки, 20-40 млн. ридов
Анализ микроРНК – 5-10 млн. ридов, чтение 36 п.н.
Single cell RNA-Seq – от 1 млн. ридов в стандартной методике до 100 тыс. ридов в модификациях.

измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования

для количественной оценки экспрессии генов