Клонирование и очистка рекомбинантного белка презентация

mCherry

глицерином

концентрация равна 107,8 нг/мкл.

Для фрагмента ДНК концентрация равна 115,1 нг/мкл.

равен V=20 μl

в лед (2 мин)
Растим в дневной культуре (LB, 370С , 1час)
Рассеиваем на чашках Петри

с 20 μl воды опускаем носик с клоном и крутим на вортексе

Собрали 10 клонов с чашки с ампициллином и 3 с контрольной чашки

μl, затем добавляем из микса по 9,5 μl. В итоге получаем 15 пробирок по 10 μl.

носиком
Оставить пробирку на льду 30 мин
Подвергнуть клетки тепловому шоку (420С) в течение 1 минуты
Оставить пробирку на льду на 2 минуты
Добавить в пробирку 400 μl жидкой среды LB (ночной) и инкубировать пробирку при 370С 500rpm 4 час
Втереть 200 μl клеток в чашки Петри с плотной средой LB

В результате получили 0,56 г осадка клеток rosetta

50 μl лизоцима
Держим 20 минут на льду (жидкость становится вязкой)
Воздействуем соникатом (вязкость исчезает)
Центрифугируем 20 минут 15000g 40C


Итог: в осадке содержатся нерастворимые белки, клеточные стенки, остатки ДНК, но большая часть белка mCherry находиться в растворе.

но не перегрузить. Собрать пару капель проскока
Когда колонка свяжется с белком, нанести washing buffer 30mM 4 ml. Собрать 50 μl раствора после того, как сольем 1 ml
Элюция 200 mM Imidazole, собрать несколько фракций

Итог собрали несколько пробирок с белком в буфере 200 mM Imidazole по 150 μl
Проскок
wash
1-ая фракция
2-ая фракция

пробы +9μl воды+SDS=20 μl
Ставим в термостат на 950С на 5 минут