Генетика клеточного цикла. Периоды клеточного цикла. Выборка к зачету презентация

Содержание

Клеточный цикл: события в клетке от деления до деления Морфологические маркеры цикла: Интерфаза (диффузное ядро) – митоз (видимые хромосомы) Биохимические маркеры цикла: Синтез ДНК (включение меченых предшественников)

Слайд 1Генетика клеточного цикла Электронно-лекционный курс Выборка к зачету 2016

Слайд 2Клеточный цикл:
события в клетке от деления до деления
Морфологические маркеры цикла:
Интерфаза

(диффузное ядро) – митоз (видимые хромосомы)
Биохимические маркеры цикла:
Синтез ДНК (включение меченых предшественников)








G1 S G2 M

Белок
РНК
ДНК

Гистоны


Биосинтез в течение цикла

Слайд 3Определение длительности клеточного цикла и его периодов

Метод меченых митозов:



Доля митозов с

меткой

время




Т цикла

G2

S

G1+M+G2

Слайд 4Распределение клеток по содержанию ДНК Данные с проточного цитометра
Краситель связывается с ДНК

пропорционально ее количеству.
Можно оценить относительную длительность каждой фазы
В синхронизированной культуре проследить изменения содержания ДНК в течение всего цикла

Альбертс, 2000

2n 4n

Слайд 5Периоды клеточного цикла
Длительность периодов клеточного цикла делящейся клетки млекопитающего
Варианты длительности

клеточных циклов:
Клетки делящиеся
Клетки эмбриональные
Клетки в состоянии покоя

Слайд 6Разработаны методы культивирования клеток
Как синхронизировать циклы клеток?
Синхронизация индукционная: обработка агентом, блокирующим

(обратимо или нет) специфический этап в клетке
- гидроксимочевина блокируют репликацию -остановка в G1
- колхицин, винбластин, колцемид – блокируют веретено деления - остановка в метафазе
Синхронизация селекционная: отбирают субпопуляцию клеток по их принадлежности к какой-либо фазе цикла.
-центрифугирование по массе – разделяют популяции G1 и G2
-смывают плохо прикрепленные митотические клетки – получают популяцию в начале G1
Синхронизация естественная: деления дробления у амфибий и некоторых беспозвоночных

Слайд 7Гетерокарионы
Опыты по слиянию клеток млекопитающих
Митоз G1
Митоз S
Митоз

G2

Существует фактор, стимулирующий митоз
Доминирование митоза над остальными фазами

фактор, стимулирующий митоз

Альбертс, 2000

Слайд 8Гетерокарионы




S


G1



Немедленная активация
репликации.
Последующий выход в G2
Одновременное вступление в митоз
Факторы,

стимулирующие S-фазу

Завершение репликации
Задержка в G2, ожидание завершения репликации




Существует фактор инициации репликации
Клетка не вступает в митоз, не завершив
репликацию.
Есть точки контроля (checkpoints), которые
останавливают клетку до завершения процесса
(arrest)

Слайд 9Гетерокарионы




G1
G2

Инициация и прохождение репликации
Повторной репликации не происходит.
Задержка в G2
Синхронное вхождение в

митоз







Блокирование ререпликации

Блокирование повторной репликации
Арест в точке контроля G2-M

Слайд 10Овогенез, мейоз и оплодотворение у лягушки
Яйцо лягушки Xenopus

Рост овоцита
Арест овоцита
в профазе

мейоза1

Прогестерон

Оплодотворение

M1,
цитокинез,
образование
полярного
тельца





Арест
в М2

Далее 11 синхронных делений дробления
Рост отсутствует


Созревание

Альбертс, 2000

Слайд 11Эксперименты с выделенными яйцами лягушки. Роль MPF в активации мейоза.
MPF

- maturation promotion factor

Прогестерон вызывает деление мейоза 1, цитокинез, образование полярного тельца, вступление в метафазу 2, арест

Инъекция цитоплазмы М2- ооцита
в ранний ооцит вызывает те же события созревания ооцита без прогестерона. MPF

Инъекция цитоплазмы предыдущего ооцита вызывает такие же изменения, как воздействие прогестерона и MPF

Ранние
овоциты
выделены
из лягушки

Арест
в метафазе2



Прогестерон

Ингибирование белкового синтеза после
воздействия прогестероном блокирует события
созревания. Перенос цитоплазмы замещает
белковый синтез.

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 12 Роль MPF в регуляции ранних эмбриональных митозов
Нормальное развитие

Задержка делений
Инъекция MPF

восстанавливает
деления


Для появления MPF необходим синтез
белка в предыдущей интерфазе
Другие белки запасены материнским
организмом

Нормальное развитие

Ингибирование синтеза белка

Ингибирование синтеза белка

Инъекция MPF


Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 13Изменение активности MPF в мейозе и ранних эмбриональных митозах лягушки

Реципиенты- ранние

ооциты в профазном аресте
Доноры – ооциты на всех стадиях и бластоциты

Доля активированных ооцитов

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 14 Осцилляция активности MPF в ранних эмбриональных митозах. Независимость реакций активации-инактивации от

готовности клеток к делению

Блокирование сборки веретена нокодазолом

Блокирование синтеза ДНК афидиколином

Нормальный эмбрион

Где же обратная связь и точки контроля?

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 15Мейоз и ранние эмбриональные митозы
Косвенные данные о существовании MPF – по

видимым изменениям, происходящим в клетке
Появлению MPF всегда предшествует белковый синтез – поиск белка, синтезируемого к метафазе.
В остальном «машина» клеточного цикла работает автономно
Блокирование репликации и разрушение ядра не останавливает остальных событий цикла – это не типично для большинства клеток

Слайд 16интерфаза
митоз
интерфаза
митоз
Другие белки
циклин
время
Количество меченых белков
Поиск белка, активирующего MPF. Открытие циклина
Измерение количества вновь

синтезированных белков в двух первых циклах деления оплодотворенного яйца морского ежа. Инкубация с мечеными аминокислотами. Пробы каждые 10 мин.

Обнаружили белок, количество которого постепенно нарастает в течение всей интерфазы и резко падает в митозе

1983, Evans, Hunt

Слайд 17Первая простая модель активации MPF:
Аккумуляция циклина активирует MPF и митоз: циклин-

часть MPF?
Активный MPF вызывает деградацию циклина и выход из митоза?
Деградация циклина инактивирует MPF?
Как соотносятся циклин и MPF?

Противоречивость фактов, полученных при изучении клеточных культур млекопитающих и цикла ранних эмбриональных делений.
Необходимость нового объекта

Циклины нашли у всех эукариот: дрожжей, кольчатых червей, насекомых, моллюсков, иглокожих, амфибий, млекопитающих и растений

Слайд 18Одноклеточный организм, гаплоидная и диплоидная фазы, короткий клеточный цикл (90 мин),

закрытый митоз, видимые маркеры клеточного цикла, простая среда для культивирования, возможность использовать микробиологические методы

Дрожжи
Saccaromyces cerevisia

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 19Селекция мутаций cdc: Cell division cycle
Обработали мутагеном.
Температурочувствительные ts -условные мутации.
Штаммы

размножают при комнатной температуре – пермиссивная: 20-23º
Асинхронную культуру переносят в условия 35-37º - рестриктивная температура.

Часть клеток продолжают клеточный
цикл без изменений – клетки ts+

Часть клеток доходит до определенной
фазы и останавливается – cdc-мутанты

Часть клеток останавливаются сразу
в той фазе цикла, в которой были – мутации
в генах домашнего хозяйства

ts+

cdc

другие

Слайд 20Температуро-чувствительные мутации
Мутантов растят при 20º на богатой среде, потом переносят в

рестриктивную температуру.
Ts- мутации распадаются на два класса:

Блокируют отдельные события цикла (cdc7 ts, cdc24 ts, cdc31 ts)




Блокируют все события клеточного цикла (cdc28 ts)



Вырастают больше других, но не делятся

Spindle
Pole
body

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 21
Логическая схема клеточного цикла (мутации cdc)
Белок Сdc28 – ключевой компонент цикла
Существует

переход Старт, после которого неизбежны почкование, репликация и удвоение клеточного центра
Существует переход Старт, после которого почкование, репликация и удвоение клеточного центра становятся нечувствительны к утрате функции Cdc28+
Старт – конец процесса перехода к репликации, точка ареста в G1 – выход в G0
Переход через Старт- вход в новый цикл репликации и деления.
Появление почки- маркер Старта

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 22Особенности биологии дрожжей
Половой процесс у S.serevisia
Два партнера для конъюгации: a и

α,
Выделяют сигнал – пептид а или α
На поверхности клеток рецепторы к ним – не к своим, а к противоположным
Для слияния клетки должны быть в одной фазе. Фактор слияния останавливает клетки в точке Старт - выход в G0
Обработку α-фактором используют для синхронизации культуры

a
гаплоид

α
гаплоид

диплоид

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 23Некоторые штаммы очень быстро переключают тип спаривания – в каждом поколении.

Образуются клетки противоположного типа. Происходит остановка клеточного цикла, слияние клеток, образуются диплоиды. Эта способность вызвана доминантным аллелем HO.
Другие штаммы сохраняют тип спаривания – рецессивный аллель ho
Локус HO кодирует эндонуклеазу
Локус МАТ кодирует регуляторы типа спаривания

Механизм переключения типа спаривания у дрожжей (mating type switching)




MAT-a –активная кассета

HML-α –молчащая кассета

HMR-a –молчащая кассета


Происходит замена кассеты и смена типа спаривания (генная конверсия)

Слайд 24Условия культивирования влияют на судьбу дрожжевой клетки. Варианты:
В нормальных условиях пройти

Старт и реплицировать ДНК
2. В условиях голода войти в фазу отдыха - G0-арест
3. Для гаплоидной клетки – вступить в половой процесс
4. Для диплоидной клетки – в споруляцию – в условиях голода

Для клетки многоклеточного организма существует R – точка рестрикции – аналог точки Старт. В ней клетка выходит в G0 и ждет сигнала извне – ростового фактора – после чего перейдёт к репликации.

Murray A., Hunt T., 1993

Особенности биологии дрожжей

Слайд 25Дрожжи, cdc-мутации

Saccharomyces cerevisiae (a),
пекарские дрожжи

Schizosaccharomyces
pombe (b),
африканские пивные дрожжи

Слайд 26Клеточный цикл
Schizosaccharomyces
pombe,
гаплоидная фаза
Маркера Старт нет. Клетки растут только

в длину.
Длина клеток в одной фазе цикла одинакова,
пропорциональна фазе цикла..

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 27Жизненный цикл Sch. pombe, гаплоидная и диплоидная фазы
n
n
2n
мейоз
голодание
Живут в гаплоидной фазе.

Конъюгация только в бедной среде, сразу мейоз.
Репликация начинается сразу после деления. Чувствительная к повреждениям ДНК стадия минимальна.

Murray A., Hunt T., 1993

Половые типы h+ и h-

Слайд 28постоянно 25º


сдвиг 25º -35º
постоянно 35º
Нормальный размер клеток
Мелкие клетки, укороченный цикл
Пороговый размер


для Старта

Пороговый размер
для митоза

Условная
мутация wee1

Длительность цикла нормальная, клетки мелкие

Мутация wee1 снижает пороговый
размер клетки для перехода в митоз

Wee1 - часть точки контроля

Есть еще точка контроля
для входа в Start

Слайд 29Нормальный размер
Не делятся
Не делятся
Делятся, не успев вырасти
Нормальный размер
Делятся, не успев вырасти
Взаимодействие

мутантных аллелей некоторых генов клеточного цикла у дрожжей Sch. pombe

Делятся очень маленькие и погибают








Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 30Нормальный размер
Нормальный размер
Нормальный размер
Делятся, не успев вырасти
Делятся, не успев вырасти
Задержка деления
Изменения

цикла в зависимости от дозы генов.







Активность белков в зависимости от дозы генов

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 31Cdc2-главный индуктор митоза

Wee1 – ингибирует Cdc2 регуляторы
Cdc25 – активирует

Cdc2


Проанализировав взаимодействия, пришли к выводам:

Слайд 32Выделение гена cdc2+. Схема эксперимента по трансфекции мутантов cdc2 плазмидами с

фрагментами ДНК дрожжей Sch. pombe

cdc2 ts: 25º

Сдвиг в 35º

Клонировали, секвенировали


Murray A., Hunt T., 1993

Мутантный фенотип

Мутантный фенотип

Нормальный рост

Мутантный фенотип

Слайд 33Схема эксперимента по трансфекции мутантов cdc2 Sch. pombe плазмидами с фрагментами

ДНК S. cerevisia

cdc2 ts: 25º

Сдвиг в 35º

Z – ген cdc28+

Гомология генов сdc2 и cdc28

Murray A., Hunt T., 1993

Мутантный фенотип

Мутантный фенотип

Нормальный рост

Мутантный фенотип

z

Слайд 34Клонировали и секвенировали гены -аналоги
сdc2 (Sch. pombe) и cdc28 (S.

cerevisia) - 60 % гомологии.
Играют ключевую роль в регуляции цикла.
Продукт гена – полипептид длиной 297 ак (34 кДа).
Протеинкиназа: Серин-треонинкиназа p34 cdc2

Аналогичным способом получили ген cdc2+ человека в культуре cdc2 ts при рестриктивной температуре.

Таким же способом получили и клонировали гены cdc13+, cdc25+, wee1+.
cdc13+ - продукт длиной 482 ак оказался гомологичен уже известным циклинам группы В.

cdc25+ - фосфатаза
wee1+ - протеинкиназа

Слайд 35К 1988 г:
генетики показали, что цикл регулируется киназами Cdc2/Cdc28 у всех

видов,
биохимики и физиологи – что MPF универсален для митоза и мейоза,
количество циклина меняется в клеточном цикле, какова его роль?

Из 1 литра лягушачьих яиц выделили 1 мкг MPF:
антитела на циклин дрожжей выявили субъединицу 46 кДа.
антитела на Cdc2 дрожжей выявили субъединицу 34 кДа.
Выявили киназную активность – по фосфорилированию гистона Н1
Свойства MPF изучали в бесклеточной системе

Слайд 36Получение бесклеточного экстракта
Яйца лягушки стимулируют электрошоком, имитируя оплодотворение. В цитоплазме повышается

содержание Са 2+, завершается М2
Яйца центрифугируют, цитоплазму отделяют от желтка и липидов
Добавляют спермии и АТФ
Ядра спермиев набухают и проходят циклы репликации- митоза за 40-60 мин

В бесклеточной системе происходит репликация ДНК, сборка веретена, расхождение сестринских хроматид, анафазное движение












Желток и липиды

Цитоплазма


ядра

Слайд 37Ген Циклина морского ежа клонировали в E.coli, получили мРНК, мРНК циклина

добавили в экстракт цитоплазмы лягушки. Наблюдали митозы

Добавили дезоксиолигонуклеотид, комплементарный мРНК циклина, в экстракт цитоплазмы лягушки. РНК-аза Н разрезает гибрид ДНК-РНК, остановка в интерфазе

Именно циклин, а не другой белок, отвечает
за наступление митоза


Взаимозаменяемость циклинов эволюционно удаленных видов

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 38Проверка гипотезы:
для инактивации MPF нужна деградация циклина.
Отсутствие деградации должно остановить

цикл в митозе.
Мутантная форма циклина: в белке отсутствует концевой фрагмент из 90 ак. Добавили в бесклеточный экстракт, деления остановились

За деградацию циклина отвечает концевой фрагмент

Слайд 39Проверка гипотезы:
для входа в митоз необходимы посттрансляционные события

Добавляли ингибитор белкового

синтеза –
Циклогексимид - противоречивые данные:
в начале интерфазы –интерфазный арест
Во второй половине интерфазы – митоз проходил

Необходимо пороговое количество циклина,
которое способно завершить митоз.
Митоз активируется не количеством циклина,
а появлением его посттрансляционных
модификаций

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 40Регуляция клеточного цикла у дрожжей
MPF: cdk+CycB митотический
М-циклин
G1-циклин
Старт-киназа: cdk+CycG1
Завершение деления клетки
Начало репликации
Центральная
Часть:

Циклин

(Cyc)
+
Циклин-зависимая киназа (Cdk)

Alberts et al., 2002

Слайд 41Циклины и Cdk высших эукариот
М-циклины продвигают события митоза
G1-циклины проводят клетку через

«старт» или точку рестрикции

S-циклины необходимы для проведения репликации

G1/S-циклины подводят клетку к репликации

Cdk1

Слайд 42CDK-каталитическая субъединица MPF, циклин - активаторная
В настоящее время известно восемь циклинов,

обозначаемых латинскими буквами от А до Н. Все циклины имеют общую последовательность длиной 100-150 аминокислотных остатков - консервативный циклиновый бокс, который необходим для связывания с CDK. На основании анализа кристаллической структуры циклин А1 состоит из двух компактных центральных доменов, каждый из которых представлен пятью спиралями, и двух дополнительных спиралей у С- и N-конца.

CDK1 ассоциируется с циклинами A и B и участвуют в переходе G2-M .
CDK2 может связываться с циклинами A , E , D2 и D3 (но не D1) и является одной из основных киназ, регулирующих переход G1-S и прохождение через S-период.
CDK3 экспрессируется в большинстве линий на незначительном уровне, и ее функция пока не выяснена, хотя предполагается, что она, подобно CDK2, участвует в переходе G1-S. Данные о роли CDK5 и о взаимодействующих с ней циклинах противоречивы.
СDK4 и CDK6 участвуют в регуляции перехода G1-S . Они являются основными каталитическими партнерами циклинов D -типа, образуя с ними функциональные комплексы, обладающие субстратной специфичностью к белку Rb.


Слайд 43
Основные циклины и циклин зависимые киназы позвоночных и S.cerevisia
Cdc28
Sch.pombe:

Cdc13 Cdc2

Alberts et al., 2002

Слайд 44Синтезировали мутантный ген cdc2, где тирозин15 заменена на фенилаланин (то же,

но без ОН)
Заместили нормальный ген мутантным

Фосфорилирование
сайта Tyr15 ингибирует Cdc2
С этим сайтом работают
wee1-киназа и cdc25-фосфатаза


Установление сайтов фосфорилирования на Cdk
Синтез аллельных вариантов гена cdc2 с аминокислотными заменами в сайтах фосфорилирования


Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 45Активность Cdk регулируется различными способами:
Циклинами (их появлением и разрушением убиквитин- зависимым протеолизом)
«грубая

регуляция»

Фосфорилированием и дефосфорилированием комплекса Cyclin-Cdk, а именно, Cdk- по 2-м позициям:
Thr161 -(T-сайт) –CAK –Cdk активирующей киназой, Tyr15 (Y-сайт) - фосфорилирование киназой Wee1 и отщепление фосфата фосфатазой cdc25 –
«тонкая регуляция»

Cdk-ингибирующими белками CKI – связывается с комплексом Cyc-Cdk, нарушая активный сайт
Быстрое выключение комплекса Cyc-Cdk


CycB

P

Y T
Cdk1


CycB


CKI

Активный MPF

Слайд 46Активация циклин-зависимой киназы Cdk
■ Присоединение циклина ■ Фосфорилирование
Cdk-активирующей киназой

САК

Cyclin

CAK

Alberts et al., 2002

Слайд 47Циркуляция комплексов Cyc/Cdk1 (Cdc2) в переходе G2-M
Пре-MPF
CycB
Y T
Cdk1

CycB
CycB
CycB
Y T
Cdk1
Y

T
Cdk1

Y T
Cdk1

P

P

P

P

CycB

CAK



Mei41, Grapes, Rad3, Chk1

CAK

Mei41, Grapes, Rad3, Chk1







Pyp3 Cdc25

Wee1

Cdc25

Cdc25





+

─

G2

митоз

Wee1

Активная
Форма
MPF

Омельянчук и др., 2003

Слайд 48Активация M/Cdk (MPF)
Alberts et al., 2002

Слайд 49Инактивация Cdk ингибирующим белком : Cdk-ингибирующий белок CKI – связывается

с комплексом Cyc-Cdk, нарушая активный сайт

Alberts et al., 2002

Слайд 50Деградация циклина происходит в 26S протеасоме

Слайд 51Две системы, обеспечивающие протеолиз:
APC (Е3)
SCF (Е3)

P


E1
E2
E2
E1
узнает
узнает
Пришивает убиквитин
Пришивает убиквитин


Протеасома
Бокс
деструкции
Специфически фосфорилиро-ванные белки
Убиквитин лигаза
Alberts

et al., 2002

В митозе

В интерфазе

Слайд 52
Участники каскада деградации белков
SCF (Е3)

Слайд 53Трансформация ядра в клеточном цикле
Разборка ламины в профазе
Филаменты ламины


Тетрамер ламинов

Фосфорилированные димеры

ламинов

Слайд 54Мутантный ген ламина человека введен в клетки китайского хомячка. Замена аминокислоты

в сайте фосфорилирования приводит к нарушению разборки ламины в митозе

Серин, серин

аланин, серин

аланин, аланин

треонин, аланин

P

P

P

P

Фосфорилирование белков ламины и распад ядерной оболочки

Мутантные варианты

Сайты фосфорилирования
MPF мономеров ламины

Норма

Разборка ламины



Замедление разборки

Замедление разборки

Нет разборки

Фенотип

Слайд 55Изучение стабильности микротрубочек в бесклеточной системе яиц лягушки:
Центросомы
Флуоресцентный тубулин
Экстракт интерфаз
Центросомы
Флуоресцентный тубулин
Экстракт

метафаз

Микротрубочек много, они короткие
Время полужизни микротрубочки 15 сек
Увеличение частоты катастроф

Микротрубочек немного, они длинные
Время полужизни микротрубочки 5 мин




M-Cdk фосфорилирует микротрубочковые моторы и МАР (белки,
ассоциированные с микротрубочками)
Белки МАР – ХМАР215- стабилизируют + конец
Белки катастрофины из семейства кинезин-подобных белков
дестабилизируют + конец, расщепляют на протофиламенты
Баланс активностей приводит к динамической нестабильности мт

Слайд 56Динамика тубулинового скелета в клеточном цикле
G1
S, G2
КЦ удвоен
Профаза ранняя микротрубочки

астральные, полюсные

Профаза поздняя микротрубочки астральные, полюсные

Метафаза микротрубочки астральные, полюсные, кинетохорные

Телофаза микротрубочки астральные, полюсные

Слайд 57Микротрубочки, образующие веретено деления
центросома
Микротрубочки
Астральные кинетохорные полюсные
Полюс

веретена кинетохоры

Alberts et al., 2002

Слайд 58Мультимеры «минус-концевых»
микротрубочковых моторов сбегаются
к «-» концам, образуя «-» концевые

фокусы

Мультимеры «плюс-концевых»
микротрубочковых моторов движутся
к «+» концам по встречным микротрубочкам,
раздвигая полюса

Самосборка веретена

Alberts et al., 2002

Слайд 59Механизм расхождения хромосом в анафазе
Совмещение двух процессов:
Анафаза А
Анафаза В
Укорочение кинетохорных микротрубочек
Удлинение

и расталкивание полюсных микротрубочек
2. Астральные мт тянут полюса к клеточной поверхности

Alberts et al., 2002

Слайд 60Кинетохорные микротрубочки в метафазе -анафазе
Метафаза

Анафаза

Разрушение «+» конца микротрубочек белками кинетохора

UF меченые тубулины

Направление движения

кинетохор

Флуоресцеин ковалентно связан с тубулином

0.75 мкм/мин

Alberts et al., 2002

Слайд 61Центромера- участок хромосомы, имеющий возможность прикрепляться к микротрубочкам. У высших организмов

формируется сложная структура- кинетохор.
Генетический скрининг проводили на клетках дрожжей, изучалась стабильность передачи минихромосомы в клеточных поколениях.
chl – chromosome loss,
msm- minichromosome maintenance,
stf - chromosome transmission fidelity,
ndc – nonedisjunction
cin – chromosome instability
dis – defective in sister chromatid disjoining
mis - minichromosome instability

Центромера и кинетохор

Слайд 62Наиболее простая центромера у S.serevisiae.
Какая минимальная последовательность обеспечивает передачу минихромосомы?
Последовательности CEN:
CDE-I

(cell cycle-dependent element) – консервативная, 9 пн, слева;
CDE-II – А-Т-богатая, 80-90 пн;
CDE-III – высококонсервативная, 11 пн, справа.


Cse4











CDE-II

CDE-III

CDE-I

CBF3

Ctf19
Mcm21
Okp1

Cse4- похож на гистон H3. Его аналог CENP-A есть у высших эукариот

Микротрубочка

CBF1

Льюин, 2012

«Минимальная единица кинетохора»

Слайд 64Структура хроматина центромерного домена
А - Растянутая хроматида в районе центромеры
CENP-A –

аналог гистона Н3:
57% гомологии с С-конца, с N-конца большие отличия
В – Центромерный район метафазной хромосомы
CENP белков описано около 20

L.Vos, J.Famulski, G.Chan, 2006

Слайд 65Конститутивная центромеро-ассоциированная сеть
CENP-C, -H, -I, -K, -L, -M, -N, -O, -P,

-S, -T, -U, -W and -X,
«constitutive centromere-associated network» (CCAN)

и другие CENP- белки

Spindle assembly checkpoint

Dileep Varma* and E. D. Salmon
Journal of Cell Science 125, 2012.

KMN (комплексы Knl1, Mis12, Ndc80)

Слайд 66Cheeseman et al., 2006
Модель взаимодействия корового кинетохора с микротрубочкой (C.elegance)

Слайд 67
Dileep Varma* and E. D. Salmon
Journal of Cell Science 125, 2012.


KMN (комплексы Knl1, Mis12, Ndc80)

Слайд 68SMC-белки в клеточном цикле (structural maintenance of chromosome)
Конденсин впервые описали у

Xenopus. Он вызывал конденсацию хромосом в бесклеточном экстракте лягушачьих яиц. АТФ-аза.
Конденсин-1 консервативен (дрожжи- человек). Скорее всего, общий предок всех эукариот имел оба конденсина (1 и 2).

Димер конденсина.
Участие конденсинов
в конденсации хроматина

Коряков, Жимулев, 2009

Хромосомы конденсируются и разделяются

Конденсины фосфорилируются киназами:
Cdk1, aurora B, polo

Слайд 69SMC-белки в клеточном цикле
Когезиновое кольцо
Коряков, Жимулев, 2009
Когезины – семейство SMC

Когезиновые кольцеобразные

комплексы вводятся перед репликацией с гидролизом АТФ
Когезия запускается белком Eco1 (Ctf7), а он связан с PCNA, кольцевым кофактором ДНК-полимеразы

Слайд 70Когезины и конденсины в клеточном цикле
Condensins: universal organizers of chromosomes with

diverse functions.
T.Hirano, 2012

Слайд 71Когезины и конденсины в клеточном цикле. Морфология хроматина в зависимости от

соотношения конденсинов 1 и 2

Condensins: universal organizers of chromosomes with diverse functions. T.Hirano, 2012

Культуры клеток млекопитающих, курицы, бесклеточный экстракт яиц Xenopus

Слайд 72Активация M-Cdk:
Индуцирует сборку веретена

вызывает конденсацию хромосом
растворение ядерной оболочки
перестройку тубулинового цитоскелета
реорганизацию

аппарата Гольджи и ЭПС
Инактивация M-Cdk:
Те же события разворачиваются
в обратном направлении

Не понятно, что вызывает сегрегацию хромосом и цитокинез?

Фосфорилирование белков этих структур или их регулирующих



дефосфорилирование

Слайд 73Переход Метафаза-Анафаза


Критическое возрастание MPF

Polo-like киназа AuroraA,В-киназы

Активация APC

Инактивация MPF Активация

сепаразы
(разрушение циклина)

Дефосфорилирование белков Разделение хроматид

Анафаза, телофаза

Слайд 74
Протеолиз циклина под контролем АРС
Polo-like-kinase
Anaphase Promotion Complex

Слайд 75Переход метафаза-анафаза у дрожжей
секурин
неактивная сепараза


Неактивный
АРС
Когезиновый
комплекс
активный
АРС
Cdc20

убиквитинизация и
протеолиз секурина

активная
сепараза

M-Cdk
Plk-1
AuroraB
Alberts et al.,

2002

Слайд 76Переход метафаза- анафаза у дрожжей
Основные участники:
APC - anaphase promotion complex –

при добавлении субъединиц Е1 и Е2 служит убиквитин лигазой
Cdc20 - белок, активирующий APC
Сепараза – протеаза, разрезающая один из когезинов (Rad21, Scc1)
Секурин- белок, инактивирующий протеазу
Polo-like – киназа 1 – активирует АРС (Plk-1)

Слайд 77Разделение сестринских хроматид в митозе

Дрожжи:

Сепараза разрезает когезины по всей длине

хромосом в переходе М-А

Позвоночные (человек, HeLa):

1. Профаза-прометафаза:
Polo-подобная киназа и Aurora- киназа фосфорилируют и удаляют когезины по плечам хромосом в течение профазы. Обособление сестринских хроматид
Белок шугошин препятствует отделению когезинов в центромерном районе (присоединяет фосфатазу).
Количество конденсинов нарастает
2. Переход М-А:
Сепараза разрезает когезины в центромерном районе

Слайд 78
Aurora киназа В - каталитическая субъединица СРС
Survivin
Borealin
INCENP


TD-60
CSC-1

регуляторный кор комплекса –
регулирует активность Aurora
киназы В

СРС- chromosomal passenger complex


Aurora серин-треонин киназа- у дрожжей (А), у дрозофилы (А и В), у человека (А, В, С).
Aurora киназа-В фосфорилирует:
Н3-гистон,
CENP-A, кинетохоро-специфичный вариант гистона Н3
INCENP- внутренний центромерный белок (между хроматидами)
Миозина II регуляторную лёгкую цепь
Топоизомеразу II α
Виментин
Десмин
MCAK (митотический центромерно-ассоциированный кинезин)
Survivin

Слайд 79СРС- chromosomal passenger complex
A-D- типичная локализация
СРС в митозе. Культура клеток курицы

.
Е- распластанные метафазные
Хромосомы в клетках HeLa

Vagnarelli P., Earnshaw W., 2004

Слайд 80CPC, хромосомные пассажиры: белки, локализованные в специфических районах:
в G2 – внутриядерно,
в

профазе митоза – вдоль конденсирующихся хромосом,
в метафазе – в центромерных районах хромосом,
в анафазе – в центральном веретене,
в телофазе- в остаточном тельце веретена

Комплекс работает в митозе и мейозе, контролирует:
Хромосомную модификацию (фосфорилирование гистона Н3)
Хромосомную конгрессию (построение)
Прикрепление кинетохоров к микротрубочкам, коррекция
Формирование стабильного биполярного веретена
Участвует в митотической точке контроля

СРС- chromosomal passenger complex

Слайд 81
Протеолиз циклина под контролем АРС.
Два белка, активирующих АРС: Cdc 20

и Hct1
Активные формы Cdc 20 , Hct1, неактивная Cdc 20, Hct1

Anaphase Promotion Complex



Alberts et al., 2002

Слайд 82Поддержание инактивации M-Cdk после митоза
Уровень циклина снижается за счет активности Cdc20-APC,

далее выпадение G1 и накопление циклина

Уровень циклина снижается за счет активности Cdc20-APC, далее –активностью Hct1-APC, Sic1

Эмбриональные клетки без G1 фазы

Клетки с G1 фазой

Alberts et al., 2002

Слайд 83Контроль прохождения G1 фазы путем изменения активности Cdk у S.cerevisia
Уменьшение количества

активной Cdk
(Cdc20-APC-обусловленный протеолиз циклина)
активирует через фосфатазы
Hct1-APC и белок Sic1. Инактивация M-Cdk белком Sic1,
убиквитин-зависимым протеолизом, снижением транскрипции



Cyc-Cdk:

Alberts et al., 2002

Слайд 84Контроль прохождения G1 фазы путем изменения активности Cdk у S.cerevisia
Аккумуляция G1-циклина

(Cln3):
на него не действуют ингибиторы.
G1-Cdk (Cln3-Cdk) запускает транскрипцию
G1/S-циклинов (Cln1,2). Активность G1/S-Cdk
инактивирует (фосфорилирует)
ингибиторы, инициирует транскрипцию
S-циклинов

Активная
форма
S-Cdk
запускает
S-фазу

Cyc-Cdk:

Слайд 85Многоклеточные организмы. Флуктуации уровней циклинов в клеточном цикле. Экспрессия циклина D

(G1 -циклина) в ответ на митоз-стимулирующие агенты (митогены)

Циклины: D - G1 E – G1 /S переход A – S, G2 B – G2, M

Для клетки многоклеточного организма существует R – точка рестрикции – аналог точки Старт. В ней клетка выходит в G0 и ждет сигнала извне – ростового фактора – после чего перейдёт к репликации.

Слайд 86Роль Rb белка в контроле перехода G1-S у многоклеточных



Rb -белок ретинобластомы

инактивирует фактор транскрипции E2F
CycD-Cdk (G1-Cdk) инициируют фосфорилирование Rb в середине G1 и высвобождает фактор транскрипции E2F.
Фактор транскрипции E2Fактивирует транскрипцию генов, связанных с вступлением в S-фазу:
G1/S-циклина (Е)
S-циклина (А)
E2F
Cdk2
энзимов, необходимых для репликации

Слайд 87Инициация репликации ДНК
у S.cerevisiae
Основные участники
ОRС-origin recognition complex (6 белков: orc1-orc6)-прикреплен к

ori в течение всего цикла
Сdc6- регуляторный белок, прикрепляется к ОРС в начале G1 (фактор, вводящий геликазу)
Cdt1/Double-parked- нужен для введения геликазы
Mcm 2-7-белки – регуляторные близкородственные белки, часть пререпликативного комплекса pre-RC (гексамерная ДНК-геликаза)
S-Cdk циклин S-зависимая киназа

ORC
Сайт присоединения ORC

G1

G2-M

S

Cdt1, Cdc6
MCM
Pre-RC



S-Cdk
запускает
S фазу


Завершение
рекликации ДНК

Фосфорилирование
ORC






Alberts et al., 2002





Деградация фосфо-
рилированного Cdc6
Геминин инактивирует
Cdt1

Слайд 88
Предотвращение повторной репликации
S-Cdk:
-запускает репликацию ДНК
-фосфорилирует Сdc6, он отделяется от ОRС- предотвращение

репликации с этого ori. Фосфорилированный Сdc6 узнается комплексом SCF, убиквитинизируется.
-фосфорилирует Mcm-белки , это вызывает их экспорт из ядра – гарантия того, что комплекс Mcm больше не соберется
-фосфорилирует Cdt1
Geminin у многоклеточных накапливается в S, G2, M
Связывается - инактивирует Cdt1 и препятствует повторной сборке пререпликативного сомплекса -лицензированию репликации

RESET: в конце митоза активность всех Cdk падает до нуля.
Сdc6 и Mcm-белки и Cdt1 дефосфорилируются,.
Геминин и все циклины Е, А и В разрушаются с помощью APC.
pre-ORC может собираться снова

Слайд 89H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009
Формы эндополиплоидии
Эндоцикл
Ререпликация
Эндомитоз
64С
Маркер митоза-
фосфо Н3
Достигают метафазы,
но нет цитокинеза

Слайд 90H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009
Примеры тканей, имеющих эндоцикл
До 1000С
Суспенсор- подвесок

Слайд 91H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009
Регуляция эндоцикла у Drosophila
Зеленым цветом отмечены

активные компоненты, красным - репрессированные
Белки, активирующие АРС: fizzy (fzy/Cdc20) – в метафазе, fizzy-related (fzr/Cdh1) – в анафазе и далее в G1
Notch индуцирует транскрипцию fzr/Cdh1, репрессирует экспрессию string/cdc25, p21/p27-ингибитора S-Cdk
Drosophila Cki Dacapo инактивирует S-Cdk

Notch

Слайд 93Какие структуры работают в точах контроля ?

Слайд 94Изучение точек контроля у дрожжей:

Получение условных мутагенчувствительных мутаций

Обработка слабой дозой радиации

(мутации rad)
веществами, блокирующими репликацию (гидроксимочевина) (мутации hus)
веществами, блокирующими сборку веретена деления (мутации mad - mitotic arrest deficient, мутации bub - budding uninhibited by benzimadazole)

Селекция мутантов с неправильной реакцией на обработку (не останавливали клеточный цикл)



Слайд 95Точки контроля клеточного цикла. Переход М-А

-дефект веретена
-дефект полюсов (в т.ч. нереплицированная

центросома)
-дефект кинетохоров

К неприкрепленному кинетохору присоединяется
белок Mad2, ингибирует Cdc20-APC

Мутации:
mad- metaphase arrest deficient,
bub – budding uninhibited Benzimadazole
Кинетохорный белок Bub1 (киназа):
запускает сборку компонентов кинетохора (BubR1, CENP-F),
Контролирует правильное формирование кинетохора.

Слайд 96Участие белков СРС- chromosomal passenger complex
в точке контроля М-А
Vagnarelli P.,

Earnshaw W., 2004

Mitotic centromere-associated kinesin (MCAK)

Слайд 97Роль СРС в точке контроля веретена
Дестабилизация и новое прикрепление кинетохора
Сигнализация о

нарушении, остановка деления

Vader G. et al., 2007

Слайд 99Точка контроля клеточного цикла. G1

G1 контроль повреждения ДНК.
Поврежденная ДНК –

активация р53 – CKI
Блок активации G1/S-Cdk, S-Cdk

G1 контроль размера клетки перед Стартом
Сln3 у дрожжей

Повышенная стимуляция митогеном.
Активация р53 – CKI - апоптоз
Блок активации G1/S-Cdk, S-Cdk

Слайд 100Болезнь «атаксия телангиэктазия»- синдром Луи-Бара – дефект одной из протеинкиназ, фосфорилирующих

р53 в ответ на облучение - ATМ-киназа (ATM – ataxia telangiectasia mutated) (ответ на двунитевые разрывы)
ATR – ATM and Rad3 related – ответ на многие формы повреждения ДНК (генотоксический стресс )
киназы фосфатидилинозитол 3-подобные.
Центральные компоненты ответа на повреждения ДНК
Белок RPA взаимодействует с однонитевыми разрывами ДНК (остановленные вилки репликации, двунитевые разрывы ДНК, сайты репарации эксцизионные, мисматч)
привлекает ATR-киназу и белок ATRIP (ATR-interacting protein)
Rad17- подобен репликативному фактору С
Rad9 – кольцевой белковый комплекс, подобный PCNA

ATM и ATR активируют серин-треонин-киназы точки контроля Chk1 и Chk2
Chk1 и Chk2 ингибируют фосфорилированием Cdc25 фосфатазу, предотвращая вступление в митоз, фосфорилируют р53.

Точки контроля клеточного цикла:
Повреждения ДНК

Слайд 101Cенсоры поврежденной ДНК
L.Zou, D.Liu and S.J.Elledge, 2003
Rad9=*PCNA
Rad17-RFC
Двунитевые
разрывы
Однонитевые
разрывы

Слайд 102Mdm2
Mdm2
p53
p53
p53
P
P
ДНК γ-лучи
Деградация в протеосоме
Стабильный активный р53
ATМ/ATR-киназы
Chk1/Ch2-киназы
Ген

р21

Транскрипция, трансляция


G1/S-Cdk
S-Cdk

G1- арест в ответ
на повреждения ДНК

Убиквитин лигаза

GADD45

Слайд 103RPA –
ATR - амплификация сигнала
ATRIP

Передача сигнала:
Активация Chk 1, 2

киназ

Эффекторная часть:
Фосфорилирование Cdc25 – остановка входа в митоз

Фосфорилирование р53 – транскрипция гена белка CKI – ингибитора комплекса cdk-cyclin



Сенсоры повреждения ДНК:

Слайд 104Контроль декатенации – проверка отсутствия зацеплений ДНК в G2 перед входом

в профазу митоза
Возможная модель сигнального пути
WRN- Вернер-геликаза (синдром Вернера), topo-II
Ингибиторы topo-II рассматриваются для использования при определенных формах рака

Слайд 105Antephase checkpoint.
Точка контроля в Антефазе отлична от контроля декатенации.
Клетки откладывают

вступление в профазу митоза (конденсацию хроматина) при обработке Х-лучами, микротрубочковыми ядами (колхицином), низкой температурой. Клетки, вступившие в профазу, деконденсируют свой хроматин (в нейробластах саранчи после облучения уменьшилось число клеток в профазе)
Короткий промежуток в конце G2
Ключевой белок – CHFR – неканоническая убиквитин-лигаза. Убиквитинизирует polo-like (Plk) киназу, тем самым воздействуя на Cdk-1, откладывая вхождение в митоз.
P38 – киназа играет роль в ответе на UV-облучение, осмотический стресс

Слайд 106Белки GADD в ответе клетки на генотоксический стресс
IR ионизирующая

UV (MMS)
радиация метилметан сульфонат


P53

GADD


Арест цикла Индукция апоптоза







cdc2 (связывается и ингибирует)
MEKK (связывается и активирует JNK каскад )
PCNA (proliferating cell nuclear antigen) прикрепляет ДНК-полимеразу δ к матрице (GADD связывается и модулирует работу ДНК-полимеразы )

GADD 45-α,ß,γ- очень кислые маленькие белки (18 kDa) с отрицательным зарядом -9 ... -12

TGFß- индуцированный апоптоз

Слайд 107Контроль целостности ДНК
G1
S
G2

Слайд 108
В точке контроля G1 р53 блокирует G1-Cdk через белок р21
В точке

контроля G2/М р53 блокирует циклин В/Cdk через инактивацию фосфатазы Cdc25
Сенсоры стресса Growth Arrest DNA Damage (Gadd 45) у млекопитающих

Действие р53
в разные периоды цикла

Growth Arrest DNA Damage (Gadd) 45

Слайд 110Надклеточный контроль клеточного деления, роста и апоптоза
Размер организма и органа зависит

от числа клеток и их массы. Число клеток определяется их рождением и гибелью
Экстраклеточные сигналы, регулирующие эти процессы, часто называют «факторы роста» в широком смысле. Для точного выражения следует различать:
Митогены – стимулируют клеточные деления, снимая внутриклеточный блок с продвижения по циклу.
Ростовые факторы – стимулируют увеличение массы клетки, вызывая синтез макромолекул и ингибируя их деградацию
Факторы выживания – супрессируют апоптоз

Слайд 111Апоптоз,
морфологические изменения:
Конденсация хроматина, фрагментация и разрушение ядра.
Цитоскелет сжимается.
Клеточная мембрана вспухает.
Клетки

фрагментируются, образуются «апоптозные тела».
Молекулярные изменения:
Возрастает концентрация Са2+
Активируются протеазы-каспазы
Разрушение ламины.
Разрезание белка, инактивирующего эндонуклеазу.
ДНК режется на фрагменты
Клеточная поверхность меняется- теряется сиаловая кислота на гликопротеинах и гликолипидах-, что вызывает быстрый фагоцитоз клетки макрофагами или соседями
На мембране появляются рецепторы витронектина, притягивающие макрофаги, фосфатидилсерин появляется на внешнем мембранном слое, фосфатидилсерин появляется на внешнем мембранном слое,

Слайд 112Каспазы - протеазы, имеющие цистеин в активном сайте
и разрезающие белки-мишени

по аспарагиновой кислоте –
caspases
Каспазы синтезируются в виде прокаспаз, хранятся в клетке долгое время.
Активируются другими каспазами разрезанием по аспарагиновой
кислоте. Амплификация протеолитического каскада.

Слайд 113Активация апоптоза с внешней стороны через Fas-путь
Fas-путь.
Лимфоцит-киллер активирует death –рецепторы

на поверхности клетки:
Fas кластеризуются, к ним присоединяются адапторные белки
и прокаспазы. Взаимная активация и каскад.
Некоторые стрессированные или поврежденные клетки убивают себя
сами, продуцируя и Fas-лиганд, и Fas-рецептор.

Слайд 114Апоптосома (700 кДа)
Активация апоптоза изнутри клетки

Слайд 115 Прокаспаза-3
Один из путей:
митохондрии
индуцируются
к выбросу цитохрома с
в цитозоль.


Цитохром с
присоединяется
к адапторному
протеину Apaf-1.
Белки Bax и Bak вызывают
выброс белка
межмембранного
пространства
митохондрий за счет
пермеабилизации внешней
мембраны

Активация апоптоза изнутри клетки

Слайд 116Митогены (более 50 белков)
Фактор роста тромбоцитов PDGF –platelet-derived grows factor
Клетки фибробластов

в культуре делились с добавлением сыворотки крови и не делились в плазме.
Плазма – забирают жидкую часть крови без образования сгустка.
Сыворотка – то же после образования сгустка.
Клетки делились при добавлении экстракта фибробластов

В организме тромбоциты стимулируют деление клеток при заживлении ран.
EGF –epidermal growth factor
PDGF (фибробласты, гладкие мышечные, нейроглиальные) и EGF – широкого спектра дейстия


Эритропоэтин – только для эритроцитов
TGF-β – трансформирующий фактор роста – одни клетки стимулирует, другие ингибирует

Слайд 117Один из путей стимуляции клеточных делений митогеном
Small GTPasa Ras
MAP-киназный каскад
Активация транскрипции

гена myc

?

Многие компоненты внутриклеточных сигнальных путей оказываются онкогенами

Alberts et al., 2002

Активация транскрипции генов, связанных с выходом из G0

Слайд 118Small GTPasa Ras
MAP-киназный каскад
Активация гена myc
Гиперактивный Ras- продукт мутантного гена ras

часто вызывает рак (рак толстой кишки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, лёгкого -30% всех случаев )
Мутация 1 ак в Ras –перманентная активность, постоянная стимуляция сигнального пути





Гиперактивация гена myc – мелкоклеточный рак лёгкого, рак толстой кишки, лимфома

Участники сигнального пути Ras и myc в онкогенезе

Слайд 119Ras- мономерная GTF-аза, имеет пренильную группу.
Ras-GEF- guanine nucleotide exchange factors

Стимуляция

митогеном сигнального пути Ras


Тирозин киназа



Протоонкогены – гены, в норме стимулирующие деление клетка. Мутация с приобретением функции (доминантная) превращает его в онкоген.
Туморсупрессоры – гены, в норме подавляющие клеточные деления. Функция утрачивается в результате мутациях в обоих генах (рецессивные).

Alberts et al., 2002

Слайд 120Фактор роста тромбоцитов (вирус саркомы обезьян)
Рецептор фактора роста эпидермиса (глиобластома, вирус

эритробластоза птиц)
Рецептор колониестимулирующего фактора M-CSF (саркома кошки)


Тирозин киназа





Участники сигнального пути Ras и myc в онкогенезе

Фосфотирозины рецептора служат докинг-сайтом для различных белков, имеющих домены SH2 (src homology region-пролин-богатые), SH3, в т.ч. Src-тирозинкиназы, PTB (phosphotyrosine binding)-домены,
Активация пути myc

Тирозин-фосфатазы специфические для определенного класса рецепторов, обеспечивают быструю отмену сигнала

Слайд 121Стимуляция митогеном сигнального пути Ras

MAP- mitogen-activated protein kinase (MAP-киназа). Для активации

необходимо фосфорилирование треонина и тирозина одновременно
Входит в ядро и фосфорилирует другие киназы и гено-регуляторный комплекс, активируя транскрипцию «непосредственно ранних генов» через минуты после сигнала – это myc-ген

Raf
и

Mek



Erk
у млек.

Alberts et al., 2002

Слайд 122В большинстве нормальных клеток гиперактивация Ras и Myc приводит к активации

точки контроля. Нормальная клетка в состоянии различить аномальную стимуляцию.

Повышенная стимуляция митогенного пути индуцирует арест клеточного цикла или апоптоз

Индуцируется синтез
ингибиторного белка р19ARF,
который присоединяется
к Mdm2 и ингибирует его.
Возрастает уровень р53
– арест или апоптоз

В раковых клетках эта система часто инактивируется мутациями в компонентах точки контроля

Alberts et al., 2002





р27

Слайд 123Другие способы регуляции митогенной активности
Репликативное старение клеток, связанное с теломерами. У

фибробластов через 25-50 делений в среде с митогенами наступает арест клеточного цикла. Активация пути р53 в ответ на повреждения теломер.
У грызунов теломераза активна. Контроль над делениями осуществляется механизмом p19ARF. Мутации в нем могут приводить к «бессмертию» культуры клеток

Количество белка CKI p27 прогрессивно нарастает в клетках, которые делятся определенное число раз, прежде чем войдут в перманентный арест при терминальной дифференцировке.
У мышей, дефицитных по р27, общее число клеток увеличено

Слайд 124Факторы роста
У одноклеточных для роста необходимо только питание. У многоклеточных –

ростовой фактор.
Увеличение скорости синтеза макромолекул и снижение скорости деградации
Путь PI 3- фосфатидилинозитол-3-киназы.

S6 киназа фосфорилирует белок S6 рибосом – трансляция набора mРНК, кодирующего рибосомные компоненты
Мутация в гене S6 киназы у дрозофилы: мухи мелкие, клетки мелкие, число нормальное
Активация трансляции фактором инициации трансляции eIF4E
Увеличение продукции регуляторного белка Myc. Он увеличивает транскрипцию белков, вовлеченных в клеточный метаболизм и синтез макромолекул

Слайд 125








Tyr740 Tyr751
Tyr771

Tyr1009 Tyr1021
Рецептор PDGR – фактора роста тромбоцитов,
одна из цепей димера
Тирозинкиназные

домены

Фосфотирозины служат докинг-сайтом для различных белков, имеющих домены SH2 (src homology region), SH3

PI3-киназа

GTPase активирующий белок

Фосфолипаза С -PLC

Слайд 126Внеклеточные сигнальные белки могут действовать как ростовой фактор, фактор выживания и

митоген одновременно: PDGF –фактор роста тромбоцитов

Ras

PI3-kinase

MAP-kinase

Myc

Рост клетки

Деление клетки

Связь роста и
пролиферации
гарантирована

В некоторых клетках рост и пролиферация контролируются независимо (эмбриогенез). Симпатический нейрон исключен из цикла, но растет пропорционально количеству NGF (nerve grows factor), который выделяет клетка-мишень

Культура нейральных предшественников:
EGF- подъем МАР-активности через 5 мин и
быстрое снижение, деления
NGF- MAP-активность высока часами,
Остановка пролиферации, дифференцировка

Выживание
клетки

Слайд 127Возможные превращения PI 3 под действием PI 3-киназы
Фосфолипаза С
Создание докинг-сайтов для

внутриклеточных сигнальных белков


Инозитол фосфолипид фосфатаза

Alberts et al., 2002

Слайд 128Если клетки лишены факторов выживания, они активируют программу апоптоза.
Нервные клетки образуются

в избытке и конкурируют за фактор, выделяемый мишенями

PDK1 - PI-dependent kinase
PKB-протеинкиназа В уходит в цитоплазму, фосфорилирует многие белки, ингибирует апоптоз (повышенный уровень во многих опухолях)

Alberts et al., 2002

Внеклеточные факторы, супрессирующие апоптоз

Факторы выживания

Слайд 129
Фактор выживания супрессирует апоптоз у млекопитающих
Протеинкиназа В
Рецептор фактора выживания активирует протеинкиназы,

в т.ч. PKB.

Bad ингибирует Bcl-2

РКВ:
1. Активирует ингибитор апоптоза Bcl-2.
2. Ингибирует гены, вызывающие апоптоз



Alberts et al., 2002

Слайд 130Некоторые сигнальные белки, действующие через тирозин-киназные рецепторы

Слайд 131Инсулиноподобный фактор роста IGF-1
Собаки крупных пород имели аллель гена IGF-1, ассоциированный

с большей экспрессией, собаки мелких пород – слабоэкспрессирующийся аллель.
У человека в промоторе гена обнаружен вариабельный участок, состоящий из CA-повторов, число которых может варьировать от 10 до 24 (в среднем их 19). Данные говорят о корреляции числа CA-повторов с уровнем экспрессии гена. В одинаковой степени как малое, так и большое число этих повторов ассоциируется со снижением циркуляции IGF-1. Носители 19 CA-повторов (их также называют носителями аллеля 192) в процессе тренировок развивают силу в большей степени, чем носители других аллелей.

Рецептор инсулиноподобного фактора роста IGFR-1
У долгожителей (старше 100 лет) и их детей чаще встречались мутации рецептора к инсулиноподобному фактору роста-1. У носителей мутаций был нарушен процесс связывания клеток с ИФР-1, повышение уровня ИФР-1 в крови на 37%
Каскад IGFR-1 влияет на продолжительность жизни

Слайд 132Конкуренция клеток за сигнальные белки
Клетки в культуре. Явление контактного ингибирования
Контактное

ингибирование клеточных делений = зависимое от плотности

Постоянно добавляется свежая среда

Монослой, нет пролиферации

Пролиферация

Пролиферация в потоке возобновляется

Плотность определяется доступностью экстраклеточных факторов

Alberts et al., 2002

Слайд 133Способность к делению зависит от формы и прикрепления клеток
Суспензия
Слабая адгезия
Хорошая адгезия
Возможность

вступления в S фазу

В среду добавили Н3-тимидин, через 1-2 дня зафиксировали и авторадиографи-ровали

8% 30% 90%

Alberts et al., 2002

Слайд 134Способность к делению зависит от формы и прикрепления клеток
Фибробласты растут на

субстрате, покрытом фибронектином (внеклеточный матрикс).
Фокальная адгезия – места контактов: актин – интегрин - фибронектин. В местах кластеризации интегринов - фокальный контакт - активация тирозин киназы FAK (фокальной адгезии), прикрепление к цитоплазматическим хвостам интегринов, кроссфосфорилирование
друг друга.
Сайты SH, присоединение киназы Src.
Две киназы продуцируют сигналы о прикреплении.



Выживание, рост, деление и перемещение.

FAK-focal adhesion kinase – активирует внутриклеточный сигнал, разрешающий выживание, рост и деление клетки.
Мыши, дефицитные по FAK, погибают в раннем развитии

Слайд 135Цитокиновые рецепторы
Jak-STAT – сигнальный путь:
Интерфероновый рецептор
Janus-киназы – цитоплазматические тирозин-киназы
STAT – signal

transducers and activators of transcription
Лиганды:
интерфероны α и γ (активация макрофагов, увеличение устойчивости к вирусной инфекции),
Эритропоэтин (выживание, пролиферация и дифференцировка эритроидного ряда),
гормон роста,
пролактин

Слайд 136Цитокиновые рецепторы: Jak-STAT – сигнальный путь
Alberts et al., 2002
Янус-киназы имеют 2

киназных домена-цитоплазматические тирозин-киназы, соединяют соседние рецепторы и перекрестно фосфорилируют их по тирозинам

К фосфотирозинам пристыковываются белки STAT и фосфорилируются

Слайд 137Внеклеточные сигналы, ингибирующие рост
TGF-β –большое семейство родственных белков. Растворимые димеры, действуют

как гормоны или локальные медиаторы, градуирующие морфогены.
Суперсемейство: TGF-β, активины и BMP
TGF-β ингибирует пролиферацию нескольких типов клеток, блокируя клеточный цикл в G1 или стимулируя апоптоз. Градуирующие морфогены в эмбриогенезе
Рецепторы TGF-β - серин-треонин киназы.
Активируется путь Smads. Изменения в транскрипции генов, регулирующих клеточные деления, дифференцировка, образование внеклеточного матрикса и смерть.
BMP- bone morphogenetic protein из семейства TGF-β. Помогает включить апоптоз в тканях между развивающимися пальцами, в молочной железе
Myostatin (то же семейство) – ингибирует пролиферацию миобластов.

Слайд 138Белки семейства TGF β (Трансформирующий фактор роста β) Действуют как гормоны

или локальные медиаторы
Представитель суперсемейства родственных полипептидов, участвующих в клеточной дифференцировке и эмбриогенезе (Dpp(dros)=BMP4(mam)). Формирование костей, хрящей, развитие половых органов.
Выполняют функции факторов роста и подавляют рост.
Чаще противодействуют митогенам, вызывая задержку клеточного цикла и развитие морфологических структур эмбриона. Стимулирует:
- синтез белков внеклеточного матрикса (коллагены 1, 4, фибронектин)
- остеогенную активность
- рост симпатических нейронов
дифференцировку клеток гладкой мускулатуры
Хемотаксический фактор для моноцитов, фибробластов, астроцитов.
Подавляет пролиферацию и функцию Т и В-лимфоцитов, эндотелиальных и эпителиальных клеток.
Вызывает апоптоз (перепонка между пальцами, молочная железа)
Секретируется определенными бластомерами, вызывая гаструляцию

Гомодимеры, масса 25 кДа. Секретируются в виде предшественника и активируются протеолизом

Внеклеточные сигналы, ингибирующие рост

Слайд 139Рецепторы TGF-β :


Тип II

Тип I
Семейство белков TGF-β:

Слайд 140Путь TGF-β - Smad
Стратегия наиболее быстрой передачи сигнала в ядро
Рецепторы

TGF-β - серин-треонин киназы.

Alberts et al., 2002

Слайд 141Участники пути TGF-β – Smad в онкогенезе
Рецепторы TGF-β - серин-треонин

киназы.



Туморсупрессор Рецептор TGF-β II (30% при раке прямой кишки)
Туморсупрессор Smad4 (рак поджелудочной и др.)

TGF-β ингибирует пролиферацию нескольких типов клеток, блокируя клеточный цикл в G1 или стимулируя апоптоз. Градуирующие морфогены в эмбриогенезе

Белки Smad могут активироваться
Src-киназой

Слайд 142

Тирозин протеинкиназы
Серин-треонин протеинкиназы
Оновные протеинкиназы
Alberts et al., 2002

Похожие презентации

Карл Линней 304
Өсімдіктердің қандай түрлері болады 1153
Яблоко. Интересные факты 499
Паразитичні бактерії (паразити) 652
Мышечная ткань. Миология 829
Характеристика липидов. Углеводы. Моносахариды. Дисахариды. Полисахариды 594

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое ThePresentation.ru?

Это сайт презентаций, докладов, проектов, шаблонов в формате PowerPoint. Мы помогаем школьникам, студентам, учителям, преподавателям хранить и обмениваться учебными материалами с другими пользователями.

Для правообладателей

Яндекс.Метрика