Эпигеномная регуляция процессов эбрионального развития млекопитающих презентация

клонированной и исходной кошки

района, отвечающего за инактивацию прилегающих участков хромосомы – центра инактивации Хic. Это предположение было сделано на основании того, что при встраивании некоторых фрагментов Х-хромосомы в состав неполовых хромосом (аутосом) происходит выключение примыкающих к месту интеграции аутосомных генов. По-видимому, такая «гибридная» хромосома, несущая центр инактивации Xic, воспринимается клеткой как еще одна Х-хромосома и учитывается при «расчете» дозы генов.
Таким образом, центр инактивации Xic является «визитной карточкой» Х-хромосомы для систем клетки. Центр инактивации Xic содержит элементы, отвечающие за подсчитывание всех Х-хромосом (центров Xic), а так же за выбор будущей единственной активной Х-хромосомы. Делеция элементов, ответственных за выбор, приводит к преимущественной инактивации Х-хромосом с интактным центром Xic, а повреждение счетных элементов центра Xic вызывает инактивацию единственной Х-хромосомы в клетках с кариотипом Х0 и ХY.

http://www.bionet.nsc.ru/labs/epigenetics/?page_id=304

В центре инактивации Xic расположен ген Xist (X-inactive specific transcript), продуктом которого является функциональная РНК, которая на ранних этапах инактивации необходима и достаточна для «выключения» генов Х-хромосомы.
Активность гена Xist негативно регулируется геном Tsix. Эти гены частично перекрываются между собой (каждая цепь участка двуцепочечной ДНК несет свою информацию) что отражено в названии последнего - Tsix, это Xist наоборот. Помимо этих двух генов в центре инактивации обнаружено еще 9 генов, для которых роль в процессе Х-инактивации пока не до конца ясна

Центр инактивации Х-хромосомы (Xic)

в ТЭ и ПЭ всегда выключаются отцовская, но не материнская Х-хромосома
Но почему в ХУ эмбрионах не выключается единственная Х-хромосома?

В Х-хромосоме, полученной от матери, есть импринт, блокирующий экспрессию Xist, (но не за счет метилирования). Этот импринт, вероятно, связан с модификациями гистонов и устанавливается во время созревания ооцитов.
В Х-хромосоме, полученной от отца, в области промотора Xist есть низкометилированные СрG-участки, деметилирование в них происходит во время сперматогенеза.

В ХХ эмбрионах инактивируются все Х-хромосомы, кроме одной (у тетраплоидных мышиных эмбрионов выключаются 3 из 4-х Х-хромосом). Почему?
В ХУ эмбрионах не выключается единственная Х-хромосома

Теория “блокирующего фактора”
Есть некий фактор (неизвестной природы), который связывается с Х-хромосомой в зоне Хic и блокирует экспрессию гена Xist. Разные аллели Xic имеют разное сродство к этому фактору. Если аллель одна, то фактор связывается с ней (нет конкуренции) и Хist инактивируется.

“Или неслучайная?”

Влияние Tsix: делеции в промоторе Tsix приводят к предпочтительной инактивации этой хромосомы. Вероятно, образование Xist-Tsix (по принципу сенс-антисенс) двуцепочечных РНК
В реконструированный ХХ эмбрионах (2 отцовских или 2 материнских пронуклеуса – так называемые андрогенетические и гиногенетические эмбрионы) нарушаются паттерны инактивации Х-хромосом
У мышей на Х-хромосоме есть локус Xce (Х-controlling element). Его аллели влияют на вероятность того, инактивируется эта хромосома или нет.

У сумчатых – Х-инактивация только по принципу импритига (всегда выключена отцовская X-хромосома)
У мыши – в ТЭ и ПЭ – импритинг, остальные ткани – случайный механизм
У человека?

H3-K4 dimethylation over the paternal and maternal Xist and Tsix promoters ensures paternal Xist and maternalTsix expression, respectively. Bold arrows represent high levels of expression, dotted arrows represent low levels of expression.

(B) At the implantation stage, an unknown ICM-specific repressive mechanism of PIC recruitment at P1 Xist promoter avoids biallelic X-inactivation (represented by a question mark and a transparent PIC at the Xist promoter). In the meantime, biallelic Tsix activation erases the histone methylation pattern by inducing high levels of H3-K4 dimethylation across the region (pink arrows), rendering both Xist alleles epigenetically equivalent.

(C) At the onset of random X-inactivation, monoallelic down-regulation of Tsix results in an increase of H3-K4 dimethylation over the corresponding Xist promoter region. The absence of ICM-specific Xist repression allows stable binding of the transcriptional apparatus, inducing high levels of monoallelic Xist expression and X-inactivation.

(D) In the female epiblast, other epigenetic marks lock in the expression profile of Xist and the silencing of Tsix transcription.

Модель регуляции активности Xist/Tsix участка в раннем эмбриогенезе мыши

т олько в последовательности ДНК.

2) Роль регуляторов громкости, усиливающих или ослабляющих действие генов, выполняют эпигенетические факторы.

3)Носителями эпигенетической информации служат химические группы, связанные с ДНК или гистонами, регулирующими упаковку ДНК в составе хромосом

4)Модификация белков обеспечивает более краткую эпигенетическую регуляцию, модификация ДНК – более длительную

здесь прометилирован:
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5'
2. Репликация ДНК: метилированность сама по себе не реплицируется, временная пассивная деметилизация ДНК
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAGCA-5'

5'-ACGTATCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5‘
3.   Метилирование цитозина поддерживающей метилазой в паре 3'-GC-5' (метилирование цитозина производится только в том случае, если напротив 3'-GC-5' в комплементарной цепи ДНК есть 5'-CG-3' с прометилированным C).
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5'
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5'
 
    Таким образом, модифицированный цитозин может наследоваться подобно обычному, передавая свою метилированность в дочернюю цепь ДНК.

Метилирование ДНК осуществляется ДНК-метилтрансферазами

Наследование уровня метилирования в ряду поколений клеток

на гипометилированные гистоны;
материнский пронуклеус – сильнее метилирован и содержит ацетилированные гистоны

маркирующий материнские и отцовские гомологичные хромосомы и приводящий к разному фенотипическому проявлению мутаций у потомства, унаследованных от матери или отца.
(от “imprint” — отпечаток)



Когда в соматических клетках проявляется изменение транскрипционной активности импринтированного гена в зависимости от его происхождения (материнский или отцовский), то говорят об
“эпиаллеле”

(ожирение);
пониженный мышечный тонус (гипотонус); пониженная координация движений;
маленькие кисти и стопы, низкий рост;
повышенная сонливость;
косоглазие; сколиоз; пониженная плотность костей; гипогонадизм (бесплодие);
речевая задержка, задержка психического развития;
более позднее половое созревание.

проблемы с питанием, плохо набирают вес;
задержка в развитии навыков общей моторики (умение сидеть, ходить);
задержка речевого развития, неразвитая речь
гиперактивность;
эпилепсия;
ходьба на негнущихся ногах — из-за этой особенности детей с этим синдромом иногда сравнивали с марионетками
нарушения сна;
косоглазие в 40 % случаев;
сколиоз в 10 % случаев;
повышенная чувствительность к высокой температуре;

дисомиями

Фенотипический эффект ОРД по какой-либо хромосоме набора выявляется лишь в том случае, если эта хромосома несет импринтированные локусы

112–119

их промоторов за доступ к общему энхансеру

На хромосоме матери энхансер активирует транскрипцию гена H19, с которого считывается нетранслируемая РНК, а ген IGF2 находится в неактивном состоянии.

На хромосоме отца в результате метилирования локуса H19 ген IGF2 становится доступным для энхансера и активируется.

ОРД по сегменту 11р15.5 отцовского происхождения приводит к двойной дозе гена IGF2,

мутация в материнском аллеле, при котором активируется IGF2 - тот же эффект

Синдром Беквита-Видемана:

http://www.beckwith-wiedemann.info/protocol_russ.html

у однопроходных млекопитающих (эволюционная дистанция с териями – 180млн. лет)

Геномный импритинг обнаруживается у сумчатых и плацентарных млекопитающих (эти группы разошлись 150 млн. лет назад)

человека (ворсинки хориона)

Buckberry S, Bianco-Miotto T, Hiendleder S, Roberts CT (2012) Quantitative Allele-Specific Expression and DNA Methylation Analysis of H19, IGF2 and IGF2R in the Human Placenta across Gestation Reveals H19 Imprinting Plasticity. PLoS ONE 7(12): e51210. doi:10.1371/journal.pone.0051210
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0051210

Для анализа экспрессии Н19 и IGF2 использовали ворсинки хориона плодов гетерозиготных по SNP (т.е. несущих разные аллели)

transcription start site (TSS).

Buckberry S, Bianco-Miotto T, Hiendleder S, Roberts CT (2012) Quantitative Allele-Specific Expression and DNA Methylation Analysis of H19, IGF2 and IGF2R in the Human Placenta across Gestation Reveals H19 Imprinting Plasticity. PLoS ONE 7(12): e51210. doi:10.1371/journal.pone.0051210
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0051210

when tissues undergo repair and differentiation, and are subjected to carcinogens, cytokines, growth factors and stress conditions. H19 gene expression is also modulated by p53 transcription factor and HGF/SF stromal factor

RNA. A reduced expression of adhesion molecules responsible for cell-cell and cell-matrix interactions together with the up regulation of genes required for extracellular-matrix metabolism, motility, and angiogenesis put H19 gene function in the core of at least the initial steps of metastatic cascade.

РНК-вирусов) или microRNA (получается из собственной РНК-предшественника). Эти процессированные РНК попадают в RISC (RNA-induced silencing complex), который разрушает мРНК и предотвращает трансляцию.

РНК-интерференция (RNAi) 

Собственные интерферирующие РНК:
1) миРНК (MicroRNA) - пост транскрипционный сайленсинг (глушение) гена
2) пиРНК (Piwi-interacting RNA) – управляют уровнем метилирования ДНК (у млекопитающих)

on the right is the clone.

Синдром генерализованного чрезмерного роста клонированных мышей

Эпигенетические нарушения у клонированных эмбрионов:
Аномальное метилирование ДНК: в норме во время дробления проходит глобальное деметилирование и происходит активация “генов плюрипотентности”, в том числе Осt-4
Аномальный импритинг, дисрегуляция генов, нарушение структуры хроматина
Синдром крупного потомства
Преждевременная гибель

Профиль экспрессии у новорожденных клонированных мышей: нарушения в 4-5% генома, но в 30-50% импринтированных генов

Бразилии (2004г.)

Клонированные животные живут меньше, чем обычные.
По некоторым данным, в клетках клонов укороченные теломерные участки.
Чтобы проверить, сократиться ли срок жизни клонов при повторном клонировании в яйцеклетки пересадили ядра из клеток клонов. При таком последовательном клонировании происходила коррекция длины теломер

fusion (pink) and transcription-factor transduction (green). These complementary approaches have provided synergistic insights for almost 50 years and continue to inform the understanding of nuclear reprogramming and influence medical advances. EG cell, embryonic germ cell.

История открытий в области репрограммирования ядер

Nature 465, 704–712 (10 June 2010) doi:10.1038/nature09229

бластоцисты выращивают культуру ЭСК и их ядра используют для клонирования новых эмбрионов

Два разных подхода к получения клонированных эмбрионов:

Эффективность обеих методик низкая, но во втором случае можно сделать сотни попыток….

Успех -50%

Успех -50%

Успех -1-2%

Успех -1-2%

ядра и технологии создания аллофенных химер.

et al., Development of transgenic cloned pig models of skin inflammation by DNA transposon-directed ectopic expression of human β1 and α2 integrin. PLoS One. 2012;7(5).

“Гуманизированные”
животные

клеткам плюри/тотипотентности

человеческих стволовых клеток из клонированных эмбрионов человека,
но его работа оказалась подделкой.

Hwang WS, Roh SI Roh SI, Lee BC Roh SI, Lee BC, Kang SK Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH, Moon SY Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH, Moon SY, Schatten G. Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science. 2005 Jun 17;308:1777-83.

Hwang WS, Ryu YJ, Ryu YJ, Park JH, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science. 2004 Mar;303:1669-74

· Apostolidou S. · Stanier P. · Moore G. Cytogenet Genome Res 113:262–270 (2006) (DOI: 10.1159/000090841)

Abstract
Growth is defined as the progressive increase in size and is listed as one of the eight main characteristics of life. In human gestation the most rapid growth phase is from 16 to 32 weeks when first there is both cell number and size increase and then from 32 weeks onwards there is continued size increase (Pollack and Divon, 1992). The mechanism of growth in utero is of fundamental interest to clinicians and scientists because of its implications for neonatal health. Growth is multifactorial in origin with both genetics and environment contributing equally large parts. Despite this complexity analysis of the candidate genes involved is possible using simple tissue biopsies at the relevant stages of development. Of particular interest in understanding fetal growth is the analysis of a group of genes that show a parent-of-origin effect known as genomic imprinting. Imprinted genes are not only found in eutherian (placental) and metatherian (marsupial) mammals but surprisingly also in plants. Nevertheless, their evolution in mammals appears to be linked primarily to placentation. It is thought to result from a potential conflict between the parents in terms of the drive to successfully propagate their own separate genes and the mother’s added drive for her survival through the pregnancy to reproduce again. This means that the mother wants to restrict fetal growth and the father to enhance it.

1)
2)
3)

Самки
1)
2)
3)

Cytogenet Genome Res. 2006;113(1-4):36-40.
Origins of extreme sexual dimorphism in genomic imprinting.
Bourc'his DBourc'his D, Bestor TH.

Roughly equal numbers of imprinted genes are subject to repression from alleles of maternal and of paternal origin. This masks the strong sexual dimorphism that underlies major aspects of imprinted gene regulation. First, imprints are established very early in the male germ line and persist for the reproductive life of the organism, while maternal genomic imprints are established shortly prior to ovulation and are erased soon thereafter in the primordial germ cells of the next generation. Second, many CpG island-associated promoters are subject to maternal methylation but no known promoters are subject to paternal-specific germline methylation. The few known paternal methylation marks are kilobases distant from the affected genes and have a low CpG density. Third, Dnmt3L is required for imprint establishment but not transposon methylation in female germ cells, while Dnmt3L is required for transposon methylation and has only a minor role in de novo methylation at imprinted loci in male germ cells. Fourth, maternally expressed genes are commonly repressed on the paternal allele by paternally expressed imprinted genes produced in cis and encoding nontranslated RNAs. It is here suggested that rapid loss of highly mutable methylated CpG sites has led to the depletion of methylation target sites in paternally repressed imprinted genes, and that an imprinting mechanism based on RNAs or local inhibitory influences of ongoing transcription of regulatory loci has evolved to counter the erosion of paternally methylated regulatory regions. This mutability model is based on the fact that paternally methylated sequences are maintained in the methylated state for a much longer time than are maternally methylated sequences, and are therefore lost at a correspondingly faster rate. The difference in timing of imprint establishment is likely to underlie the increasing sexual dimorphism of other aspects of imprinted gene expression.