Набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени Фемофлор. презентация

в режиме реального времени Фемофлор.

ЗАО «НПФ ДНК-Технология»
2009 г.

значительные ограничения в изучении микробиологических сообществ. Главные из них:
недостаточная дискриминация микроорганизмов по морфологическим признакам;
cложности в культивировании большинства микроорганизмов.
Внедрение молекулярно-биологических методов позволило открыть большое число новых микроорганизмов, расширить, упорядочить, а в некоторых случаях пересмотреть знания о таксономии.
По современным оценкам более 90% микроорганизмов окружающей среды ранее не могли быть культивированы и идентифицированы. В случае биоценоза кишечника эта цифра составляет более 60%.
Вагинальный биоценоз представляет собой сложную сбалансированную систему. Учитывая его влияние на протекание и исход беременности и на инфицированность верхнего отдела урогенитального тракта, изучение вагинального биоценоза, его состава и принципы регуляции и восстановления в норме и при патологиях представляет собой крайне важную задачу.

женщин вагинальная экосистема хорошо сбалансирована и стабильна. В 1 мл вагинальной жидкости в среднем содержится около 109 бактерий (CFU - колоний образующих единиц).
В норме основным компонентом вагинального биоценоза являются лактобактерии. Они участвуют в метаболизме гликогена, который эксклюзивно вырабатывается клетками вагинального эпителия, превращая его в молочную кислоту и приводя к закислению – в норме pH 3,8 – 4,5.
Кислый pH в сочетании с выработкой бактериоцина (bacteriocin) и перекиси водорода создает защиту, препятствующую колонизации урогенитального тракта женщин другими микроорганизмами.
Кроме лактобактерий в норме могут присутствовать другие микроорганизмы, например Staphylococci, group B Streptococci, Corynebacterium, Prevotella, Peptostreptococcus, Gardnerella, Enteric bacteria и другие, причём похоже, что существуют их устойчивые сочетания. В норме количество этих микроорганизмов составляет около 104 -107 CFU/ml.

биоценоза связаны с вагинитами и вагинозами.

Устойчивость биоценоза к воздействиям обусловлены:
генетическими факторами связанными с функционированием иммунной системы, прежде всего врожденного иммунитета;
составом биоценоза (вагинальной микрофлоры);
внешние факторы (LifeStyle)

ясна. Считается, что из-за снижения количества лактобактерий, но почему оно снижается?

При снижении количества лактобактерий возникает «замкнутый круг»:

Снижение кол-ва лактобактерий
Уменьшение продукции H2O2

Рост ассоциированных с баквагинозом бактерий

Повышение pH

мнение, что баквагиноз не болезнь, а «неприятность» и в большинстве случаев специфическое лечение не назначалось.
С 80-х из-за различных осложнений «на всякий случай» стали лечить антибиотиками против анаэробов – metranidazole и clinamycine (рекомендованы Центром Контроля Болезней, CDC).
Стандартное лечение метранидазолом и клинамицином в течение недели помогает в 80-90% случаев.
Однако, в течение трех месяцев в 15-30% случаев рецидивирует, так называемый рецидивирующий баквагиноз.
Проблема не в том, как убрать «плохие» бактерии, а в том как восстановить нормальный биоценоз.

решается сейчас

Врач
Осмотр
Жалобы
Микроскопия неокрашенного мазка
Лаборатория
Посев на флору
Микроскопия окрашенных мазков
По Граму
Метиленовым синим
ПЦР
Качественная оценка условных патогенов

флору
Длительные сроки культивирования, повышенные требования к транспортировке и хранению материала
Не все типы микроорганизмов растут равномерно – в процессе роста теряется соотношение между ними
Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов
Отсутствие возможности культивирования большинства анаэробов
Повышенные требования к лаборатории
Микроскопия мазка
Субъективность оценки (изменчивость микроорганизмов, необходимость диагностировать много морфотипов)
Не все микроорганизмы видны в световой микроскоп
Как следствие - ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов
Невозможность сопоставить результаты
Приблизительная количественная оценка
ПЦР качественными методами
Не дает представления о соотношении микроорганизмов между собой
Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов
Нет количественной оценки

условными патогенами

Существующие в настоящее время подходы к диагностике условно-патогенной флоры не всегда информативны для врача, т.к.


Не дают представления о соотношении микроорганизмов, составляющих биоценоз, между собой
Выявляют ограниченный спектр микроорганизмов
Не дают количественной оценки

или
оценка биоценоза?

Диагностика баквагиноза – «кто победил, хорошие или плохие?». Ответ типа «Да/Нет» - есть БВ или нет.
Оценка биоценоза – количественная характеристика состава «хороших» и «плохих», оценка их «сил», устойчивости биоценоза.

условно патогенной флоры

Анализ 20-ти образцов, взятых с потока в лаборатории, с выявленной ДНК Gardnerella vaginalis

о состоянии биоценоза в целом:


Информация о соотношении общей обсемененности урогенитального тракта, лактобактерий и различных групп микроорганизмов является ключевой при оценке состояния биоценоза и, как следствие, состояния пациентки
Важна количественная оценка групп микроорганизмов, что позволит оценивать динамические изменения состояния биоценоза

литературным данным более 100 различных видов микроорганизмов могут входить в состав биоценоза урогенитального тракта у женщин. Эти микроорганизмы можно сгруппировать по признаку генетического родства. Для выявления этих групп и были разработаны реагенты.

исследования урогенитального тракта у женщин, позволяющий анализировать состояние биоценоза в целом, оценивать соотношение микроорганизмов между собой.
Многофакторный (23 группы микроорганизмов, общая бактериальная масса, контроль взятия материала. Итого: 25 показателей)
Уникальный по составу выявляемых микроорганизмов
Количественный
Точный
Высокая аналитическая чувствительность
Высокая аналитическая специфичность
Наглядный (ПО + выдача результатов)
Быстрый и несложный в использовании (стандартные методики выделения ДНК и ПЦР амплификации)
Наличие готовых файлов с программами для ДТ-96 – исключение ошибок и потери времени при программировании амплификатора

количественно выявлять следующие группы показателей:

Общую бактериальную массу
Лактобактерии
Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы)
Анаэробные микроорганизмы
Микоплазмы
Грибы
Контроль взятия материала
Контроль прохождения реакции

105 063 от 13.02.2008
«Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности»
№2008 118 641 от 14.05.2008
«Способ диагностики инфекционно-воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин»
РУ ФСР 2009/04663

Расширенная этиологическая диагностика условно-патогенной и нормофлоры (23 группы микроорганизмов)
Количественная оценка общей бактериальной массы
Количественная оценка лактобактерий (нормофлоры)
Контроль взятия биологического материала
Оценка эффективности проведенного лечения
Подробный мониторинг восстановления нормоценоза

Диагностика наиболее распространенных микроорганизмов условно-патогенной флоры – 5 групп микроорганизмов
Количественная оценка общей бактериальной массы и лактобактерий
Контроль взятия биологического материала
Контроль проведенного лечения
Фемофлор 8
Расширенная диагностика микроорганизмов условно-патогенной флоры (9 групп микроорганизмов)
Количественная оценка общей бактериальной массы и лактобактерий
Контроль взятия биологического материала
Контроль проведенного лечения

урогенитального тракта у женщин определяется количество микроорганизмов в транспортной среде, пропорциональное общей обсемененности соответствующего биотопа.
Для исключения ложноотрицательных результатов предусмотрен контроль взятия материала.

Интерпретации подлежат результаты со значением контроля взятия материала более 104 (4 Log).
При КВМ менее 104 (4 Log) необходимо связаться с врачом для выяснения состояния пациента или дополнительно взять материал.

материала от врача
Синими и красными ромбами
обозначены образцы,
взятые разными врачами







КВМ (контроль взятия материала)

Общая бактериальная масса (Log)

уровня отсечки ( Log)
Возможность анализировать результаты по отдельным группам организмов, выставляя индивидуальный уровень отсечки для каждого из них

с возможностью настройки под решаемую задачу, обследуемую группу пациентов, конкретного врача
Возможность количественной оценки различных групп микроорганизмов и выявление соотношений между ними
Выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphaera, Dialister, Lachnobacterium)
Выявление групп микроорганизмов, диагностика которых методом ПЦР до сих пор не была представлена
Возможность проведения динамических наблюдений
Возможность проведения научных исследований (в том числе и популяционных)

всех параметров
Программное обеспечение, максимально облегчающее работу врача лаборанта:
отчет о проведенном исследовании выдается программой в доступной для анализа врача-клинициста форме
готовый файл загрузки (Фемофлор.ini) с программой амплификации, что существенно экономит время и исключает ошибки ручного программирования прибора (ДТ-96)
определение положения стрипа в термоблоке, позволяющее исправить допущенные ошибки при установке стрипов

программное обеспечение

Детектирующий термоциклер ДТ-96, «ДНК-Технология»

лабораториях:

НИИ Акушерства и гинекологии им. Отта (СПБ)
ЦНИИА и Г им. Кулакова (Москва)
МЦ Асклепий (Владивосток)
ООО МЦ АВИЦЕННА, лаборатория Авиценна Плюс (Владивосток)
ГУЗ "КДЦ" МЗ Хабаровского края "Вивея"
Клиника «Здоровье человека» (Благовещенск)
Центр новых мед. технологий (Новосибирск)
Ассоциация независимых клинико-диагностических лабораторий «Ситилаб» (Казань)
УРНИИ Дерматовенерологии (Екатеринбург)
ДЦ Гармония (Екатеринбург)

2006, http://www.medicusamicus.com/index.php?umonth=9&action=1x856-2-4a-5a-13gx2

Исследование мазка на лейкоциты
Качественный ПЦР анализ на безусловные патогены (хламидия, гонорея, трихомонас)

мазок).

на выделения из влагалища целесообразно проводить скрининговое исследование состояния урогенитального биоценоза методом количественной Real-Time PCR «ФЕМОФЛОР 16»
«С помощью методов генодиагностики возможно выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphera, Dialister, Lachnobacterium), мониторинг эффективности лечения» УРНИИДВ (Екатеринбург)

«Тест-система Фемофлор-16 является чувствительным инструментом для исследования биоценоза влагалища беременных женщин, позволяя выявлять как выраженные отклонения от нормы, так и только намечающиеся.» ДЦ Гармония (Екатеринбург)

нормоценоза характеризуется следующими показателями:
Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log)
Общая бакмасса от 106 до 108 (6-8 Log)
Нормофлора от 106 до 109 (6-9 Log) относительно ОБМ – от 0-до 0,5 – нормальный уровень
Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора относительно ЛБ меньше 3 – нормальный уровень
Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) – отсутствуют;
Уреаплазмы: больше 104 диагностически значимый уровень
Грибы рода Candida. Менее 103 (<3 Log). диагностически незначимый уровень

Нормальный биоценоз обладает свойствами устойчивости и саморегуляции.


∗ для женщин репродуктивного возраста.

дисбаланс
Состояние умеренного дисбаланса характеризуется следующими показателями:
Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log)
Общая бакмасса от 106 до 108 (6-8 Log)
Нормофлора (Lactobacillus spp.) 0-0,5 относительно ОБМ – нормальный уровень
Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора Относительно ЛБ больше -1 – значительно увеличенный уровень.
Микоплазмы: отсутствуют;
Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum + parvum) больше 104 - диагностически значимый уровень.
Грибы рода Candida. Менее 103 (<3 Log). Диагностически незначимый уровень

дисбаланс
Состояние выраженного дисбаланса характеризуется следующими показателями:
Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log)
Общая бакмасса может иметь нормальный, повышенный или пониженный уровень.
Нормофлора (Lactobacillus spp.) – относительно ОБМ - значительно сниженный уровень
Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора отличается разнообразием микроорганизмов. Доля большей части представителей условно-патогенной микрофлоры превышает долю лактобактерий в общей бактериальной массе. Значительно повышенный уровень.
Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) – могут присутствовать в диагностически значимых количествах.
Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum + parvum) могут присутствовать в диагностически значимых количествах.
Грибы рода Candida. присутствие более 103 (>3 Log) – диагностически значимый уровень.

жалоб нет, здорова

раз думать
Грамотно брать материал
Проводить дополнительные анализы
Работать в тесном контакте с клиницистами
http://www.dna-tech.ru/information/fordoctors/diagnosticsippp/

биоценозов урогенитального тракта женщин репродуктивного возраста
Жалобы без клинических проявлений (U,V,C)
Случаи несовпадения клиники и лабораторных исследований
Повторные обращения после лечения
Оценка эффективности ЭКО
Оценка эффективности проведенного лечения
Оценка восстановления нормофлоры
Проблемы с невынашиванием беременности
Исследования биоценозов беременных женщин
Оценка объема предполагаемой терапии
Исследования биоценозов женщин в менопаузе

репродуктивного возраста (67 пациенток в возрасте от 19 до 49 лет, 32 года)
Клинически здоровые
Патологические проявления
Воспалительные процессы


Женщины в менопаузе ( 33 пациентки в возрасте от 41 до 73 лет, 53,3 года)
Физиологическая норма
Сухость слизистой

бак.масса 106,5 (105,7-106,8 ) ГЭ
Лактобациллы 106,1 (105,4- 106,6) ГЭ
Доля лактобацилл 78 (50-79)%
Доля Gardnerella 0,1 (0-6,3)%

«Патология»
Общая бак.масса 107,2 (106,6-107,6) ГЭ
Лактобациллы 104,3 (102,0-106,6) ГЭ
Доля лактобацилл 0,8% ((0-37,6))
Доля Gardnerella 15,8% (9,0-29,9)

Eubacterium spp. (p=0,000091), Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp. (p=0,000018), Peptostreptococcus spp. (p=0,0008), Atopobium vaginae (p=0,003).

бак.масса 106,5 (105,6-107,1 ) ГЭ
Лактобациллы 104,4 (101,1- 106,5) ГЭ
Доля лактобацилл 3 (0-56)%
Доля Gardnerella 18 (0-32)%

«Патология» (сухость слизистой)
Общая бак.масса 105,0 (104,3-105,3 ) ГЭ
Лактобациллы 102,6 (100,0- 105,3) ГЭ

Доля лактобацилл 7 (0-12)%
Доля Gardnerella 12 (3-30)%

биоценоза в целом
Современные методы диагностики
Данный анализ более информативен, т.к. позволяет проводить сравнение количества бактериальной массы с лактобактериями – определение объема назначаемой терапии
Данный анализ выявляет многие микроорганизмы, которые не видны в микроскоп или не растут на питательных средах – определение этиологии инфекционного процесса
Возможность проведения динамических наблюдений
По сравнению с посевом на питательные среды (срок исполнения 5 дней) этот анализ гораздо быстрее - результаты могут быть получены в течение суток

информативная диагностика за 1 визит к врачу
Данный анализ позволит пациенту избежать избыточного лечения (гиперпрагмазии)
Индивидуально подобранная терапия для каждого пациента
Возможность контролировать проведенное лечение и восстановление нормальной флоры
Стоимость количественного определения каждого из показателей сопоставима (или даже меньше), чем стоимость неинформативного в данном случае качественного анализа методом ПЦР