Генетический контроль радиочувствительности у человека презентация

А.В. Рубанович

rubanovich@vigg.ru

Различия высоко значимы по точному критерию Фишера: р=0,0054

Обычно имеют в виду следующее:

Группа людей с высоким уровнем спонтанных аберраций

Распределение частот спонтанных аберраций хромосом в лимфоцитах крови большой группы доноров (реальные данные, 250 доноров)

Различия высоко значимы
по точному критерию
Фишера!

Группа людей с предрасположенностью к соматическому мутированию???

Совсем не обязательно!
Необходимо сравнить с
пуассоновским распределением
(с таким же средним)

А в этой группе вероятно есть устойчивые к соматическому мутированию

Но это лишь косвенное доказательство существования
изменчивости индивидуальной радиочувствительности!

Однозначный ответ могут дать только сравнения
дозовых зависимостей выхода хромосомных аберраций
отдельных доноров

Прямые доказательства:

Единственный регулярный источник данных о радиационном поражении in vivo на уровне организма

Единственное неоспоримое доказательство

Отношение площадей под кривой выхода аберраций в клетках обследуемого донора и соответствующей контрольной кривой при облучении в диапазоне 0,25-3 Гр

Выход индуцированных хромосомных аберраций у больных атаксией и синдромом Дауна повышен в 1,5-2 раза

Для каждого донора построена кривая выхода аберраций при облучении в диапазоне 0,25-3 Гр

Кстати для выживаемости: площадь под кривой выживания (в линейном масштабе) равна средней «убивающей» дозе

Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек, по сравнению с алгоритмом вычисления LD50

Прямые доказательства:

Что свидетельствует о генетическом
характере изменчивости
индивидуальной радиочувствительности?

Полиморфизмом гена GSTP1 можно объяснить
∼35% изменчивости реакции на радиотерапию

…но лучше этого
не делать!

Прямые доказательства:

Обусловлена редкими мутациями. Тестируя кандидатов в космонавты,
вы их не найдете!

Вспомним терминологию:

Полиморфизм – ген представлен в популяции двумя и более аллельными вариантами. При этом частота более редкого (минорного) аллеля > 5%

Мутации – редкие (< 1%) и обычно вредные аллели

Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный. Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок.

Дупликации – в популяции встречаются хромосомы с несколькими копиями одного гена

STR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов
(микро- и минисателлиты). Нейтральная изменчивость в некодирующей части ДНК.

- каждый второй

… и каждый пятый из нас!

CNV – copy number variations

Фенотипы: нормальная обычно пониженная
активность активность фермента

A

CGGGAGCCGATTT - аллельный вариант С (мажорный, предковый)
CGGGAGТCGATTT - аллельный вариант Т (минорный, мутантный)

SNP - однонуклеотидные замены оснований в ДНК - первопричина генетической изменчивости (2005)

Полиморфизм – одновременная встречаемость в популяции обоих вариантов (с частотой > 5%):

GCCCTC

GCTAAA

T

C

CGGGAG

CGATTT

G

Нормальная последовательность
(в гене MTHFR)

Генотипы: С/C C/T T/T

Реальный пример: SNP в экзоне гена MTHFR.
Фермент 5,10-метилен тетрагидрофолатредуктаза, ответственный за метилирование ДНК и синтез тиминов.
Аллель Т часто сопряжен с предрасположенностью к онкозаболеваниям

Полиморфен каждый десятый ген с частотой
встречаемости аллелей до 50%

Мы отличаемся друг от друга в среднем каждым
тысячным нуклеотидом (2009 - двумя на 1000)

Описаны 7 000 000 SNP (MAF>5%)
и 4 000 000 SNP (1% (0,3% всего генома) – апрель 2009

Minor Allele Frequency

Это не сиквенс, а гаплотипы, т.е. нуклеотиды в соседствующих сайтах SNP

Кандидатные полиморфизмы:

гены репарации ДНК

гены детоксикации ксенобиотиков и оксидативной защиты

гены клеточного цикла и апоптоза

∼

?

XRCC1, XRCC3, APE, XPD, XPG, XPC, RAD51, OGG1

MTHFR, p53, CCND1

CYP1A1, CYP2D, GSTM1, GSTT1, GSTP1, SOD2, MDR1, NAT2

Как выявить сопряженность (корреляцию, ассоциацию) частот аберраций и генотипов?

Далее потребуется статистический анализ

Гомозигота по мажорному аллелю

Гомозигота по минорному аллелю

Обычно стараются рассмотреть две группы

Самое простое и необходимое: вычисление средних частот аберраций для носителей различных генотипов. Далее сравнение по непараметрическому тесту
(не по Стьюденту!)

Группа людей с нулевым уровнем аберраций

Далее вычисляются относительные риски (OR)
и значимость по точному критерию Фишера.
В данном примере риск возникновения аберраций
у носителей минорного аллеля G равен OR=2,1 и р=0,015

Статистический анализ сопряженности частот аберраций и генотипов

OR – количественная мера предрасположенности (Odd Ratio)

OR>1 – генотип связан с болезнью
OR=1 – нет связи между генотипом и болезнью
OR<1 – протективный генотип

OR показывает во сколько раз повышена вероятность заболеть для носителя «плохого» генотипа

Логистическая и пуассоновская регрессии

р – частота аберраций
xi – генотип i-го локуса
аi – коэф. регрессии

Зависимая переменная – частота (р),
независимыми переменные – генотипы (xi).
Например так: A/A - 0, A/T - 1, T/T - 2

Нелинейные многомерные регрессии,
реализованные в пакетах Statistica и SPSS

Самое простое и необходимое: вычисление средних частот аберраций для носителей различных генотипов. Далее сравнение по непараметрическому тесту
(не по Стьюденту!)

Статистический анализ сопряженности частот аберраций и генотипов

Прямые доказательства:

«Сначала я говорил, о чем буду говорить,
затем говорю,
потом буду говорить, о чем сказал»
Правило английского проповедника

B. Karahalil, S. Sardas, et al. Mut. Res., 515 (2002)

Аберрации, индуцированные 1 Гр:
GSTM1 0/0 > GSTM1 +

Генотипы

Аберрации, индуцированные 2 Гр:
GSTM1 0/0 < GSTM1 +

Противоречия с предыдущей работой
вероятно связаны с «плохой» статистикой:
в обеих работах анализировали
50-100 метафаз для 15-30 доноров

При этом основное внимание будет уделяться высокополиморфным локусам

Планируются:
SOD2, MDR1, XRCC1, CCND1, COMT

Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (500 метафаз для каждого из 92 доноров)

Средний уровень 0,009 ± 95% доверительный интервал

По суммарному количеству спонтанных
аберраций генотипы не различалсь

0

10

20

30

40

50

60

< 0,001

0,001-0,003

0,003-0,005

0,005-0,007

>0,007

Частота аберрации хромосомного типа

Относительная частота, %

0/0 (35)

Спонтанные аберрации:
GSTM1 0/0 < GSTM1 +

GSTM1

Доноры, «свободные» от аберраций хромосомного типа:
57% «нулевых» против 27% «положительных»
(OR = 3,4; p = 0,0081 по точному критерию Фишера).

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

00

(11)

+0

(19)

0+

(24)

++

(38)

Генотипы по локусам

GSTM1-GSTT1

Частота спонтанных аберраций

Хромосомные

Хроматидные

Дицентрические и кольцевые хромосомы, ацентрики, атипичные моноцентрики

Обмены, одиночные и изохроматидные фрагменты

У двойных гомозигот по делециям частота аберраций хромосомного типа в 4,5 раза ниже, чем у остальных генотипов (р = 0,016).

Генотипы по GSTM1 отличались частоте аберраций хромосомного типа лишь на 30% (р = 0,04).

Различия по частоте хроматидных аберраций не значимы

GSTM1 +
GSTT1 0

GSTM1 0
GSTT1 +

Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (500 метафаз для каждого из 92 доноров)

Средний уровень 0,123 ± 95% доверительный интервал

Число локусов (из набора GSTP1, MTHFR и NAT2) несущих минорные аллели

Все локусы
(GSTP1, MTHFR и NAT2) гомозиготны по мажорному аллелю

Хотя бы один из локусов
GSTP1, MTHFR и NAT2 несет минорный аллель

Все локусы
(GSTP1, MTHFR и NAT2) несут минорные аллели

Два локуса из
GSTP1, MTHFR и NAT2 несут минорные аллели

r=0,25; p=0,0065

2
(40)

3
(9)

Частота спонтанных аберраций

Хромосомные

Хроматидные

Средние частоты спонтанных аберраций хромосомного и хроматидного типа для различных генотипов по локусам
GSTP1, MTHFR и NAT2

Для спонтанных аберраций тенденция роста незначима

Высокую частоту TCR-мутаций имеют
носители минорного аллеля G в локусе CYP1A1
OR=20,6 ; P=0,0002
по точному критерию Фишера

CYP1A1
HFE147
COMT
HFE845
CYP2D6
GSTM1
GSTT1
GSTP1
NAT2
MTHFR

Повышенная частота TCR-мутантных клеток
характерна для гомозигот по минорным аллелям
локусов HFE187, GSTM1 и MTHFR
(пониженная активность соответствующих ферментов)

Различия достоверны только
для GSTM1

Некоторые удивительные итоги

Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с
репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью
хромосом

Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще
сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем
цитогенетических нарушений

Ранговая корреляция r=0,27; p=0,004

Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с
репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью
хромосом

Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще
сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем
цитогенетических нарушений

Спонтанные и индуцированные
аберрации хромосом: случаи когда
GSTM1 0/0 < GSTM1 +

Частота аберраций для GST 0/0
Частота аберраций для GST +

Спонтанные и индуцированные
аберрации хромосом: случаи когда
GSTT1 0/0 < GSTT1 +

Тип воздействия.
0 – спонтанный уровень

ХА – хромосомные аберрации
СХО – сестринские хроматидые обмены
МЯ - микроядра

Повышенная устойчивость гомозигот по делециям GST
скорее является правилом, чем исключением

Предрасположенность ко многим распространенным
системным заболеваниям (рак, астма, бесплодие,
гипертония, болезнь Альцгеймера)

Почему этот вывод выглядит крамолой?

Это бесспорно!
Глутатион-S-трансферазы
– это все-таки детотоксиканты

В основном данные противоречивы.

При этом прослеживается желание приписать «нулям»
предрасположенность к любым недугам

8 видов «детских» раков

13 генотипов

OR=6,4
P=0,007

OR=2,3
P=0,018

Контроль

Обычная методика позволяет
увидеть лишь такую картинку:
эффектов нет

+/+ и +/0

Методы генотипирования,
позволяющие различать генотипы +/+ и +/0
(ПЦР в реальном времени, продленный режим амплификации)

Некоторые цитаты и спекуляции:

Показатели антиоксидантной защиты (активность глутатион пероксидазы, церулоплазмина и др.) выше при наличии в пуле GST одного или нескольких функционально менее активных вариантов

Повышенная репарационная способность как компенсаторный эффекта дефицита GSTM1

При избытке активного GST нарушается нормальный ход апоптоза

И все же должен существовать более универсальный механизм
поддержания делетированного аллеля GSTM1*0 в популяции:

Популяционная частота GSTM1*0 превышает 70% !

В результате каждый второй из нас (0,72=0,49)
не продуцирует фермент, ответственный за обезвреживание
очень широкого класса генотоксикантов

Частота «нулевых» генотипов GSTM1 в контрольных выборках:
слабая, но достоверная тенденция к возрастанию за 20 лет

Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с
репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью
хромосом

Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще
сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем
цитогенетических нарушений

Частоты индуцированных аберраций хромосом для «однолокусных» генотипов (1 Гр in vitro)

Разительных или хотя бы достоверных отличий не обнаружено!

Лишь слабая корреляция с общим числом минорных аллелей в локусах
GSTP1, MTHFR и NAT2

Может быть мы изучаем не те полиморфизмы?

Похоже, это – общее правило:
сильные эффекты в ассоциативных исследованиях
полиморфизма ДНК никогда не воспроизводятся

…и еще больше работ с отсутствием достоверных эффектов

Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,1÷1,2)

Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими совершенно различными заболеваниями (признаками)

Итоги 10 лет GWA-исследований

GWA (Genome-Wide Association):
ассоциативные исследования с использованием микрочипов.
Генотипирование по > 100 000 SNP

Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,1÷1,2)

Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими совершенно различными заболеваниями (признаками)

Куда подевалась остальная изменчивость,
и что мы ловим в исследованиях типа GWAS?

Пока за счет SNP-изменчивости удается объяснить не более 30% наследуемой изменчивости количественных признаков

Human genetic variation and its contribution to complex traits
K. Frazer, S. Murray et al. Nature (April 2009)

Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный. Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок.

Дупликации – в популяции встречаются хромосомы с несколькими копиями одного гена

STR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов
(мини- и микросателлиты). Нейтральная изменчивость в некодирующей части ДНК.

Делеционный полиморфизм
генов GSTM1 и GSTT1 –
это тоже CNV !

Тестовая и контрольная ДНК метятся разными красителямм

Тестовая и контрольная ДНК конкурируют за гибридизацию с ДНК-фрагментами на микрочипе

Количественный сигнал, полученный после
компьютерного анализа изображений

Если участок в тестовой ДНК дуплицирован, то наблюдается импульс красного цвета

CNV: ключевые цитаты
(∼ 30 работ из Nature, Science, PNAS et al., 2007-2009)

CNV регулярно и в больших количествах обнаруживаются в клетках различных раковых опухолей

Устойчивость к HIV/AIDS сильно коррелирует с числом копий гена CCL3L1 (chemokine (C-C motif) ligand 3-like 1, 17q21.1)

Спорадические CNV, возникающие de novo, сильно ассоциированы с аутизмом и шизофренией

Делеции GST 15 лет лидируют по количеству значимых результатов в ассоциативных исследованиях

У мужчин длина Y-хромосомы сильно коррелирует с предрасположенностью к криминальному образу жизни

Главное отличие человека от шимпанзе на уровне генома – большое количество дупликаций

Похоже, широко распространенные SNP не вызывают существенных изменений радиочувствительности хромосом и организма в целом

С этим лучше не спешить! Будем говорить о подозрениях:

Похоже, существуют селективные факторы, поддерживающие полиморфизм структурной изменчивости генома на исключительно высоком уровне