ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ презентация

Александровна
Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина

Научный руководитель:
доктор физ.- мат. наук, проф.
Горбенко Галина Петровна

новых зондов

Актуальность

Метод флуоресцентных зондов

Недостатки имеющихся красителей:

токсичность

фотонеустойчивость

«плохая» спектральная область флуоресценции

Бензантроновые и тиазоловые (полиме-тиновые) зонды

липофильность

большие «стоксовы сдвиги» и коэффициенты экстинкции чувствительность к полярности
и вязкости среды

фибриллярными и префибриллярными агрегатами лизоцима, а также с модельными мембранами клетки – липосомами, с целью получения качественных флуоресцентных маркеров этих биообъектов

которой бета-складки лежат перпендикулярно оси фибриллы, а бета-слои – вдоль ее направления. Зрелые фибриллы имеют диаметр 3 – 12 нм и состоят из 2 – 6 закрученных протофиламентов, имеющих диаметр 2 – 5 нм

Объекты исследования. I. Aмилоидный лизоцим
и модельные плазматические мембраны

Микрофотография фибрилл лизоцима. Инкубация белка в 80% этаноле в течении 30 дней по методу Холли

Липосомы – униламеллярные везикулы диаметром 100 нм, состоящие из смесей ФХ с КЛ и ХОЛ, были получены методом экструзии. Эти везикулы – модельные мембраны клеток

Структура липосомы

9300 M–1 cм–1), поглощением при 453–519 нм и излучением в длинноволновой области спектра, т. е. не пересекается с флуоресценцией биообъектов (УФ-область). Удлине-ние полиметиновой цепи позволяет конструировать зонды с разной областью флуоре-сценции, т. к. сдвигает максимум поглощения вдлинноволновую область. Зонды являются производными Тиозолового Оранжевого, содержащие ациаминозамести-тели в бензотиазоловой части.

500 – 700 нм, большим стоксовым сдвигом. Чувствительны к полярности и вязкости окружения. Не флуоресцируют в буфере, а только в неполярной среде. Производные бромобензантрона, синтезированные нуклеофильным замещени-ем атома брома в 3-бромобензантрона

в липосомах различного состава

Зависимости изменений интенсивности флуоресценции от концентрации липида. ФХ – фосфатидилхолин, КЛ – кардиолипин, ХОЛ - холестерин

молярная флуоресценция ( а )

Кр характеризуют взаимодействие зонда с мембранами. Поиск Кр осуществляется аппроксимацией функции:

Δ Imax- предельная интенсивность флуоресценции, [L] - концентрация липида, γ - общий объем липидной фракции в мембране

[Z] - общая концентрация флуоресцентного зонда

а характеризуют квантовый выход зонда в среде. Поиск а осуществляется из уравнения:

и КрLi - коэффициенты распре-деления зонда в ФХ, ФХ/КЛ и ФХ/ХОЛ липосо-мах, соответственно, Zdye=1 – заряд красителя

Поверхностный потенциал
мембраны

С1 лучше всего проникает в ФХ/КЛ(10%) липосомы, его молярная флуорес-ценция в ФХ ХОЛ(30%) липосомах.
Коэффициенты распределения С1 в липосомы различного состава достаточно большие

С16

III. Титрование нативным лизоцимом зондов С4, С6, С8,
С16, связанных с мембранами ФХ/КЛ(10%)

Высокие значения коэффициентов распределения→ хорошее связываниие
Катионных зондов с отрицательно заряженными модельними мембранами
ФХ/КЛ(10%). По сравнению с зондом С1 эти параметры выше в 5-6 раз
По возрастанию коэффициента распределения зонды выстроились в ряд: С6 →
С8 →С16 → С4 → С1
По возрастанию молярной флуоресценции ряд следующий: С8 → С4 → С6 →
С1 → С16

где IVV – вертикально поляризованные возбуждение и излучение, IVH - вертикально / горизонтально поляризованное возбуждение / излучение

Формула для вычисления анизотропии

Измеряли анизотропию флуоресценции красителей в каждой точке титрования

% → увеличение вязкости микроокружения

Зависимость анизотропии флуоресценции зондов от концентрации лизоцима

агрегатами и нативным лизоцимом

Спектры флуоресценции зонда АМ1 (0.3 мкМ) при
титровании красителем фибрилл лизоцима

Z0 – общая концентрация зонда, Ka – константа ассоциации, n – стехиоме-трия связывания, Ср – концентрация белка, a – молярная флуоресценция связанного зонда

Модель Ленгмюра

Аппроксимация уравнения в Math-cad → параметры связывания

→ А6 → А4 → АМ3 → АМ2 → АМ1 → С1
По возрастанию квантового выхода в присутствии фибрилл: С1 → А4 → АМ3 → А8 → А6 → АМ2 → АМ4 → АМ1
АМ1 - лучший для фибрилл за счет Kа и a, больших, чем у Тиофлавина Т (ThT). Стехиометрия n, т. е. число мест связывания на молекуле белка у всех зондов одинакова

По увеличению сродства к олигомерам зонды образуют ряд: АМ2 → А6 → А8 → АМ4 → А4 → АМ1 → АМ3
По возрастанию квантового выхода в присутствии фибрилл: АМ2 → А4 → А8 → АМ3 → А6 → АМ1 → АМ4
Лучший зонд для детекции олигомеров - АМ4. К нативному белку сродство всех зондов, меньше на порядок, кроме А6, имеющего большее сродство

содержащим отрицательно заряженный кардиолипин. Лучшим в этом смысле оказался зонд С1, для которого построена модель встраивания в липосомы. Лучшим для характеристики белок-липидного взаимодействия оказался зонд С8

Большинство производных бензантрона показали хорошее связывание с фибриллами и префибриллярными агрегатами лизоцима. Для фибрилл лучшим оказался зонд АМ1, для олигомеров – АМ4. Параметры АМ1 оказались даже лучше, чем у классического амилоидного маркера – Тиофлавина Т. К нативному лизоциму имеет хорошее сродство только зонд А6

Полученные знания о новых флуорофорах позволяют расширить область применения этих красителей

Выводы