Стволовые клетки презентация

Содержание

Слайд 1Стволовые клетки
Мензоров Алексей Гавриилович
Баттулин Нариман Рашитович
Список ресурсов для подготовки к зачету:
https://vk.com/stemcells2017

Слайд 2Фамилия Имя Отчество, номер группы

В чём разница между naïve и primed

плюрипотентностью?

Активна ли теломераза в эмбриональных стволовых клетках человека?

Список ресурсов для
подготовки к зачету:
https://vk.com/stemcells2017

Слайд 3Теломераза и теломеры в стволовых клетках человека
Hiyama, Hiyama, 2007

Слайд 4Опрос на прошлой лекции
ЭС клетки человека и мыши получают из внутренней

клеточной массы бластоцисты.
Клетки плюрипотентны, если при дифференцировке дают производные трех зародышевых листков. Присутствие молекулярных маркеров ЭС клеток (Oct4, Sox2, Nanog) недостаточно.

Слайд 5Можно ли говорить о степени плюрипотентности?

Есть ли «высокая» и «низкая»

плюрипотентность?

Слайд 6Пример: тератомы из клеток MES29
Menzorov et al., 2015

*
*
*
*
*
*
*
*
*

Слайд 7«Стволовость»
http://www.csa.com/discoveryguides/stemcell/overview.php (с модификациями)
# - http://www.brighthub.com/science/medical/articles/27331.aspx

Слайд 8Соматические стволовые клетки
http://stemcells.nih.gov/info/basics/

Слайд 9Термины
Соматические стволовые клетки
Взрослые стволовые клетки
Тканевые стволовые клетки
Постнатальные стволовые клетки

Слайд 10Определение
Соматические стволовые клетки – недифференцированные (или частично дифференцированные) клетки в

тканях и органах
Они обладают способностью к самообновлению и дифференцировке в различные специализированные клетки

Слайд 11Функция стволовых клеток
Поддержание гомеостаза путем регенерации старых, поврежденных или погибающих клеток.


Слайд 12Самообновление и регенерация
Самообновление
Активация → асимметричное деление
Пролиферация и дифференцировка клеток-предшественников (ограниченный потенциал)
Linheng

Clevers, 2010

Слайд 13Ниша стволовых клеток
Соматические стволовые клетки и клетки-предшественники есть во всех органах

и тканях
Они находятся в так называемых «нишах стволовых клеток»
Ниша стволовых клеток – особое микроокружение, поддерживающее и регулирующее рост стволовых клеток
Мутации, получаемые клетками сигналы, изменения микроокружения могут активизировать стволовые клетки

Слайд 14Ниша стволовых клеток
межклеточное взаимодействие,
клеточные контакты,
компоненты внекл. матрикса*,
концентрация кислорода,
цитокины,
pH, осмотическое давление
↓
состояние покоя
самообновление

(белым)
дифференцировка

Feng et al., 2012

Слайд 15Типы соматических стволовых клеток
Гемопоэтические стволовые клетки: кровь и иммунная система
Эпителиальные

стволовые клетки: кожа, выстилающие клетки
Нейральные стволовые клетки: нейроны, глия, олигодендроглия
Мезенхимальные стволовые клетки: костная ткань, хрящ, жировые клетки; миоциты
Мышечные клетки-сателлиты
Стволовые клетки печени
…

Слайд 16Гемопоэтические стволовые клетки
https://www.biolegend.com/cell_markers

Слайд 17Самообновление
Дифференцировка
Мобилизация в кровоток и обратно
Апоптоз

Свойства гемопоэтических стволовых клеток

Слайд 18Гемопоэтические стволовые клетки
Гемопоэтические стволовые клетки способны полностью сформировать кроветворную систему реципиента

ГСК

некоторые рассматривают как модель тканевых СК

Слайд 19Дифференцировка ГСК

Слайд 20Orkin, Zon, 2008
Транскрипционные факторы, необходимые для гемопоэза
Нарушение экспрессии… лейкемия
LT-HSC, long-term hematopoietic

stem cell;
ST-HSC, short-term hematopoietic stem cell;
CMP, common myeloid progenitor;
CLP, common lymphoid progenitor;
MEP, megakaryocyte/erythroid progenitor;
GMP, granulocyte/macrophage progenitor;
RBCs, red blood cells

Слайд 21Репрограммирование судьбы клеток, трансдетерминация
ГСК
предшественник миелоид. ряда
предшественник лимфоид. ряда
предшественник
мегакариоцитов
и эритр.
предшественник


гранулоцитов
и макрофагов

Слайд 22Иерархическая модель гемопоэза в костном мозге
Wang, Wagers, 2011
«Определить» ГСК с помощью

поверхностных маркеров не удается

Слайд 23Поверхностные маркеры ГСК
Wang, Wagers, 2011

Слайд 24Проточная цитометрия
Flow cytometry

Слайд 25©1990-2012 J. Paul Robinson, Purdue University BMS 631
Проточная цитометрия
Технология, позволяющая

измерять свойства единичных клеток
Измерение флуоресценции, рассеивания света и других параметров клеток и частиц

Слайд 26©1990-2012 J. Paul Robinson, Purdue University BMS 631
Цитометрия и сортировка
Проточная

цитометрия
Измерение характеристик клеток в потоке
Проточная сортировка
Сортировка (разделение) клеток на основе измеренных характеристик
Также называется сортировка клеток на основе флуоресценции (Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)). Термин FACS используется для сортировки, но не для анализа клеток!

Слайд 27Цитометрия/проточная цитометрия
Цитометрия
Возможна локализация антигена
Количественный анализ клеточных типов затруднен
Ограниченное число одновременно измеряемых

параметров

Проточная цитометрия
Локализация антигена неизвестна
Анализ большого количества клеток за короткое время
Одновременное измерение группы параметров

James Marvin, Northwestern University

Слайд 28Проточная цитометрия (упрощённо)













James Marvin, Northwestern University

Слайд 29Рассеяние света
При взаимодействии с клеткой луча лазера, клетка рассеивает свет во

всех направлениях.
Рассеянный свет попадает на детекторы.

James Marvin, Northwestern University

Слайд 30Original from Purdue University Cytometry Laboratories
James Marvin, Northwestern University
Прямое рассеяние
Детекция по

оси луча лазера.
Интенсивность ~ размер клетки
Forward Scatter = FSC = прямое рассеяние

Слайд 31


Original from Purdue University Cytometry Laboratories
James Marvin, Northwestern University
Боковое рассеяние
Детекция луча

лазера, отраженного под углом 90 градусов к оси.
Интенсивность сигнала ~ количество цитозольных структур (гранулы, клеточные включения,…)
Side Scatter = SSC = боковое рассеяние

Слайд 32Зачем нужно соотношение FSC vs. SSC?
Так как FSC коррелирует с размером,

а SSC – с внутренней структурой, их соотношение позволяет разделить клеточные типы в гетерогенной клеточной популяции

James Marvin, Northwestern University

Слайд 33Каналы флуоресценции
При прохождении луча лазера через клетку внутренние или внешние флуорохромы

могут поглощать свет и переходить в возбужденное состояние
После поглощения энергии флуорохромы могут вернуться в нормальное состояние с выбросом энергии в виде фотона с определенной длиной волны, более длинной, чем исходная (эффект Стокса)
Эти фотоны проходят через собирательные линзы и разделяются по каналам с помощью фильтров.

James Marvin, Northwestern University

Слайд 34Флуоресценция
http://ru.wikipedia.org

Слайд 35Детекторы флуоресценции


Original from Purdue University Cytometry Laboratories, Modified by James Marvin

Слайд 36Фильтры
Клетка может рассеивать волны разной длины. Для независимой детекции разных

длин волн их разделяют фильтрами.
Оптические фильтры поглощают или отражают некоторые длины волн, в то же время пропуская другие.
Типы фильтров: low pass, high pass, band pass

James Marvin, Northwestern University

Слайд 37Типы фильтров

Слайд 38Выбор фильтров
http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp

Слайд 39Как это работает?
FITC
FITC
Антитела распознают специфические молекулы на поверхности клеток
Неспецифика
При проточной цитометрии

клетки, экспрессирующие маркер, к которому специфичны антитела, имеют флуоресцентный сигнал. Остальные клетки не флуоресцируют.

К антителам искусственно прикреплены флуорохромы

Антитела

Hector Nolla, University of California

Слайд 40Гидродинамическое фокусирование позволяет достичь прохождения через луч лазера единичных клеток
Hector Nolla,

University of California

Устройство цитофлуориметра

Слайд 41Ламинарное течение
Внутренняя струя
Внешняя струя
Hector Nolla, University of California

Слайд 42


Каждая клетка дает флуоресценцию


PE FL
FITC FL







488nm Sct









Конфокальные линзы
Дихроматические линзы

















Фотоумножители

Разделяющие фильтры
Детектор прямого

рассеяния



Hector Nolla, University of California

Слайд 43Клетки без флуоресценции также детектируются




PE FL
FITC FL







488nm Sct









Конфокальные линзы
Дихроматические линзы




















Детектор прямого

рассеяния

Hector Nolla, University of California

Слайд 44Схема оптики
Hector Nolla, University of California

Слайд 45Анализ данных
Усиление сигнала на фотоумножителях
Преобразование аналогового сигнала в цифровой
Запись данных на

компьютер

Слайд 46


Диаграмма рассеяния света





































Прямое рассеяние света (FSC)
Рассеяние света 90 градусов (SSC)
больше
более гранулярные
живые

клетки

Большие клетки

мёртвые клетки

Клетки в апоптозе

Ось X

Ось Y

Hector Nolla, University of California

Слайд 47Гистограмма – один параметр



















1 2 3 4 6

7

150 160 170 .. 190

Уровень сигнала

Позитивные

Негативные

Ярче

Бледнее

Число событий


1

4

6

Флуоресценция по каналу FITC

Hector Nolla, University of California

Слайд 48



















































FITC FL
PE FL
Негативная популяция
Популяция клеток, позитивных только по FITC
Популяция клеток, позитивных

только по PE

Популяция клеток, позитивная по двум маркерам

Hector Nolla, University of California

Гистограмма – два параметра

Слайд 49Данные цитометрии
Меньшая область – в основном живые клетки
Все клетки – большая

область

Hector Nolla, University of California

Слайд 50Hector Nolla, University of California
Цитофлуориметрия и сортировка
FACS

Слайд 51Внутренние
Реагенты и пробы не требуются (структура):
Размер клеток (прямое рассеяние света, FSC)
Гранулярность

цитоплазмы (рассеяние света под углом 90 градусов, SSC)
Фотосинтетические пигменты

Внешние
Требуются реагенты:
Структурные
Содержание ДНК
Соотношение дНТФ
Содержание РНК
Функциональные
Поверхностные и внутриклеточные рецепторы
Синтез ДНК
Деградация ДНК (апоптоз)
Экспрессия генов

Hector Nolla, University of California

Измеряемые параметры клеток

Слайд 52Может быть этого слайда было бы достаточно?













FACS

Слайд 53Поверхностные маркеры ГСК
CD – cluster of differentiation
(cluster of designation)
Wang, Wagers, 2011

Слайд 54Гемопоэз в развитии мыши
желточный мешок

эмбриональная печень эмбриональная печень

и
аорто-гонадный мезонефрос
(участок эмбриональной мезодермы)

Orkin, Zon, 2008

Слайд 55«Перемещение» гемопоэза
Orkin, Zon, 2008
de novo возникновение ГСК



Миграция и функционирование
(migration and engraftment)
ECs

– эндотелиальные клетки

LT-HSC, long-term hematopoietic stem cell;
ST-HSC, short-term hematopoietic stem cell;
CMP, common myeloid progenitor;
CLP, common lymphoid progenitor;
MEP, megakaryocyte/erythroid progenitor;
GMP, granulocyte/macrophage progenitor;
RBCs, red blood cells

Слайд 56О мышах и людях
Wang, Wagers, 2011
AGM – аорто-гонадный мезонефрос
Liver – печень
Spleen

– селезёнка

de novo
возникновение ГСК


Слайд 57Виды ГСК
Долгоживущие – способны полностью восстановить кроветворение у летально облученной мыши.

Если повторно пересадить другой летально облученной мыши – также восстанавливают кроветворение.
Короткоживущие – полное восстановление кроветворения, но снижена способность к самообновлению.

Как определить долгоживущие ГСК человека???

Слайд 58Термины
Мобилизация – выход в кровяное русло под действием цитокинов (например Г-КСФ,

гранулоцит-колониестимулирующий фактор) и/или хемо- и радиотерапии.
Хоуминг – процесс нахождения ГСК своей ниши.
Отличается от способности отвечать на сигналы окружения (engraftment – «приживление»).

Слайд 59Ниши ГСК в костном мозге
Остеобластная ниша
Васкулярная ниша
Orkin, Zon, 2008

СВЯЗАНЫ?
Хемокин CXCL12 –

регуляция миграции ГСК,
c-Kit – стимуляция гемопоэза,
…

Слайд 60Функции ниши ГСК
Обеспечение выживания
Обеспечение самообновления
Обеспечение пролиферации

Слайд 61Молекулярные основы хоуминга ГСК в костный мозг
Magnon, Frenette 2008
Хоуминг – процесс

нахождения ГСК своей ниши.
Отличается от способности отвечать на сигналы окружения (engraftment).

Слайд 62ИПСК → ГСК in vivo
Mol Ther. 2013 Jul;21(7):1424-31. doi: 10.1038/mt.2013.71. Epub

2013 May 14.
Generation of engraftable hematopoietic stem cells from induced pluripotent stem cells by way of teratoma formation.
Suzuki N1, Yamazaki S, Yamaguchi T, Okabe M, Masaki H, Takaki S, Otsu M, Nakauchi H.

Слайд 63Идея получения ГСК in vivo
Suzuki et al., 2013
В тератоме – дифференцировка

в нише

Слайд 64Схема эксперимента
Suzuki et al., 2013
PB – peripheral blood
BM – bone marrow

Слайд 65Процент лейкоцитарных клеток (CD45+ GFP+) донора
Suzuki et al., 2013

SCF – “фактор

стволовых клеток”,
TPO – тромбопоэтин,
OP9 – стромальные клетки («фидер»).


Слайд 66ГСК из ИПСК человека
Suzuki et al., 2013
ГСК in vitro – хоуминга

нет – нужно вводить в костный мозг.
ГСК in vivo – «нормальная» дифференцировка, проходят хоуминг.

На этапе ИПСК можно исправлять генетические дефекты.

Слайд 67Нативный гемопоэз мыши
Sun et al., 2014; Busch et al., 2015
~5000 (30%)

участвуют в гемопоэзе взрослой мыши,
одновременно – тысячи клонов.

Отличие гемопоэза при трансплантации – ГСК дают все типы клеток крови.

Слайд 68Вирусные инфекции, кровопотеря, стресс… старение(?)
Walter et al., 2015
http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
C57BL и другие линии

Слайд 69ГСК в 115 лет
Holstege et al., 2014
~450 соматических мутаций в клетках

крови. Клетки крови – потомки 2 (близких) клонов ГСК.
Укороченные теломеры.

Слайд 70Источники ГСК в клинике
Костный мозг: 1 клетка на 1 000 000

– LT-HSC,
Периферическая кровь (после действия Г-КСФ) (CD34+ Thy-1+),
Пуповинная кровь,
Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток и ИПСК (формирование LT-HSC не доказано),
Трансдифференцировка.

Слайд 71Применение ГСК в клинике
Лейкемии и лимфомы (аллогенная трансплантация)
Наследственные заболевания крови (аллогенная

трансплантация)
Онкологические заболевания (хемо- и радиотерапия, аутологичная трансплантация)

Слайд 72Клинические испытания
3106 клинических испытаний с использованием ГСК
https://clinicaltrials.gov/

Слайд 73Проблемы
Долгоживущих ГСК мало
ГСК не удаётся эффективно культивировать in vitro
Иммунологическое отторжение трансплантата,

реакция «трансплантат против хозяина»

Слайд 74Сателлитные клетки мышц

Слайд 75Сателлитные клетки мышц
Небольшие клетки на периферии мышечных волокон,

спутники.

Слайд 76Сателлитные клетки мышц
Электронная микрофотография
х30000
мышечное волокно
сателлитная клетка
межклеточная щель
базальная мембрана →
Anderson 2006

Слайд 77Свойства
Активация сателлитных клеток в ответ на травму или повреждение базальной мембраны


→ регенерация мышечных волокон
Самообновление и дифференцировка
Потенциал к делению ограничен

Слайд 78Эмбриональный миогенез
Shi, Garry 2006

сомит
Нервная трубка
Нотохорд
Эктодерма
Склеротом
Миотом
Дермомиотом
Конечность
Формирование сомитов из параксиальной мезодермы

Слайд 79Регуляция миогенеза
Сигнальные факторы регулируют каскад молекулярных событий обеспечивая баланс между пролиферацией

и дифференцировкой

Слайд 80Эмбриональный миогенез
Разделение сомитов на дермомиотом, миотом и склеротом
Shi, Garry 2006
Кожа, скелетные


мышцы корпуса

скелет

ПП мышцы

В развитии мыши
Пара сомитов формируется около 2 часов,
всего 60 пар сомитов

Слайд 81Эмбриональный миогенез
Активация миогенной программы (Myf5+ и MyoD+ клетки)
Shi, Garry 2006
Pax3+ и

Pax7+ клетки в центральном участке дермомиотома мигрируют в центр миотома и продолжают пролиферацию без экспрессии MyoD – большинство будущих сателлитных клеток

Слайд 82Эмбриональный миогенез
Pax3, Myf5 и Myf6 регулируют экспрессию транскрипционного фактора MyoD
Shi, Garry

2006

Pax3

Myf5

Myf6

MyoD

Миогенез
Myog, Myf6, MyoD

Слайд 83Экспрессия MyoD в сомитах (A) и мышцах (B)
E11.5 MyoD-GFP
Shi, Garry 2006
E13.5

35S-меченая рибопроба

Слайд 84Экспрессия генов при регенерации
Shi, Garry 2006
ядра миофибрилл
покоящиеся сателл. кл.
пролиферация
и самообновление
регенерация ядер
покоящиеся

сателл. кл.

покоящиеся
сателлитные клетки

активация и пролиферация

повреждение

слияние

дифференцировка

созревание

клетки-предшественники

миобласты

миофибрилла

пролиферация

дифференцировка




десмин, миогенин

2 часа

Слайд 85Временные параметры регенерации
Shi, Garry 2006
2 часа

Слайд 86Ниша сателлитных клеток
Ядро миоцита
Ядро сателлитной клетки

Базальная мембрана
Сарколемма
Миофибриллы
Моторные нейроны
Клетки имм. системы

ниша СК
Васкуляризация

Shi, Garry 2006


Слайд 87Альтернативные источники мышечных стволовых клеток
Shi, Garry 2006
Иерархия неясна

Слияние клеток?

Похожие презентации

Применение лекарств, эффект плацебо и первая помощь 327
Операции при мелком преддверии полости рта. Френулопластика 382
Диагностика и лечение лёгочного сердца 587
Патофизиология белой крови 574
Определение групп крови с помощью цоликлонов анти-А и анти-В 477
Оптические методы диагностики MRI/NIR IMAGING 308

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое ThePresentation.ru?

Это сайт презентаций, докладов, проектов, шаблонов в формате PowerPoint. Мы помогаем школьникам, студентам, учителям, преподавателям хранить и обмениваться учебными материалами с другими пользователями.

Для правообладателей

Яндекс.Метрика