Образовательный курс: Regional Capacity-building for Integration of Next Generation Sequencing in the Clinical Microlab презентация

Course

Участие в образовательном курсе
«Regional Capacity-building for Integration of Next Generation Sequencing in the Clinical Microlab»

30/10 – 1/11, 2017 Herzliya, Israel

Руководитель отдела: д.м.н. Т.В. Припутневич.

Докладчик: с.н.с., к.б.н. А.Б. Гордеев.

University,
Нидерланды, Индекс Хирша (Scopus)-45.

Paul Savelkoul, Maastricht University, Нидерланды,
Индекс Хирша (Scopus)-39.

Jacob Moran-Gilad, Ben-Gurion University,
Beer Sheva, Израиль,
Индекс Хирша (Scopus)-22.

Dag Harmsen,
Universitatsklinikum Münster,
Германия, Индекс Хирша (Scopus)-38.

в медицинской микробиологии.
Eric Claas, Leiden, Нидерланды – Основы NGS I. Обзор платформ и оборудования для проведения секвенирования.
John Rossen, Groningen, Нидерланды – Основы NGS II. Экстракция нуклеиновых кислот и приготовления библиотек для проведения NGS микроорганизмов.
Интерактивное обсуждение. Как реализовать «мокрое» NGS в лаборатории клинической микробиологии.
Joao Andre Carrico, Lisbon, Португалия – Обзор подходов к молекулярному типированию бактериальных патогенов.
Jacob Moran-Gilad, Beer Sheva, Израиль – Углубленное NGS I. Как получить клинически значимую информацию из бактериальных полногеномных нуклеотидных последовательностей?
Dag Harmsen, Münster, Германия – Углубленное NGS II. Возможности типирования бактерий с использованием NGS.

часов)

< 12 часов

Лаборатория «мокрой»
биологии (Wet-Lab)

Интернет-Лаборатория
(E-Lab)

«Быстрая микробиология»
- результат <24 часов

< 6 часов

Современная микробиологическая лаборатория не может обходиться без молекулярно-генетических методов

Методы должны быть одним из инструментов микробиолога

последовательности. Применяется в различных областях биологии и медицины (генетика человека, клиническая микробиология и т.д.)

1977 г. – появление секвенирования как метода (А.М. Максам и У. Гилберт) – метод химической деградации меченной ДНК.
1977 г. – метод Сэнгера (секвенирована последовательность фага phiX174 – статья в Nature) – метод обрыва цепи.

Примерно десять лет назад:
Next Generation Sequencing (секвенирование следующего
поколения, высокопроизводительное секвенирование)
- дешево – быстро - удобно

секвенирование.
Illumina: секвенирование синтезом. Линейка секвенаторов в зависимости от целей секвенирования и объемов.
PacBio: SMRT-секвенирование – линейная амплификация.
Pacific Biosciences – SMRT-секвенирование отдельными молекулами полимеразы.
Oxford Nanopore.

Процесс проведения NGS:

Выделение
ДНК/РНК

Приготовление
образцов/библиотек

Секвенирование

Сборка

Биоинформатический анализ
типирование (SNP)
резистентность к антимикробным
препаратам
типирование вирулентности

видов или
подвидов.

Результат: определение подтипа / типа /
клона / линии.
Фенотипические методы:
рост и морфологические характеристики
физиологические характеристики:
тестирование чувствительности к
антибиотикам и тяжелым металлам
серотипирование
Генотипические методы:
экстрахромосомальные методы:
плазмидный фингерпринтинг
хромосомальные:
RFLP / AFLP / RAPD / PFGE
Методы, основанные на секвенировании:
MLST / MLVA
spa / emm

энтеробактерий.
John Rossen, Groningen, Нидерланды – Применение NGS для изучения вспышек госпитальных инфекций.
Paul Savelkoul, Maastricht, Нидерланды – Метагеномика I. Применение NGS для анализа микробиомов.
Maria Luisa Ricci, Rome, Италия – Метагеномика II. Применение для исследования водных систем.
Eddie Cytryn, Modiin, Израиль – Метагеномика III. Применение для надзора за антибиотикорезистентностью в окружающей среде.
Amparo Fernandez Rodriguez, Madrid, Испания – Метагеномика IV. Применение для микробиологических задач судебной экспертизы.
Jacob Moran-Gilad, Beer Sheva, Израиль – Применение NGS для решения задач программы «One Health» («Единое здоровье»).
Интерактивное обсуждение. Интерпретация результатов NGS. Точка зрения клиницистов.
Интерактивное обсуждение. Вопросы качества при реализации новой технологии в лаборатории клинической микробиологии.

вопросы:

На сегодняшний момент допустили ли вы колонизацию и
инфицирование?

Типирование для определения генетического сходства (изолят)
Проведение скрининга (клинический образец)
Метагеномика (клинический образец)

2. Есть ли у нас инфекция и какая?

Видовая идентификация по 16S (16-23S) рДНК (клинический образец)
Метагеномика (клинический образец)

3. Какой может быть оптимальная терапия?

Определение генов вирулентности и резистентности (изолят)
Метагеномика (клинический образец)

преимущества перед «классическими» вариантами типирования:
намного выше селективность.

Пример:
Escherichia coli. Во время вспышки госпитальной инфекции выделено 2 изолята.
Цель – установить их родство и показать, являются ли они эпидемиологически
значимыми.

Изолят 1

Изолят 2

Изолят,
вызвавший
вспышку

MLST – 7 генов
cgMLST – 1 423 гена

СТ-24
ST-117

СТ-71
ST-117

СТ-24
ST-117

данных геномов и генов, контроль качества бактериальных геномов.
Интерактивное обсуждение. Я секвенировал бактериальный геном – что дальше?
Joao Andre Caricco, Lisbon, Португалия – Биоинформатика II. Графическое представление результатов полногеномного (WGS) анализа.
Ines Steffens, Solna, Швеция – Рекомендации при подготовке публикации исследований с использованием NGS. Взгляд со стороны редакции журнала “Eurosurveillance”.
Заключительное обсуждение.

образцов/библиотек
аппаратная база
квалификация персонала
Требования к основным характеристикам: число контигов < 1000, показатель N50 > 15 000, максимальная длина контига > 50 000, покрытие > 30X, процент использованных ридов > 90%.

2. От умения специалистов правильно провести биоинформатический анализ и правильно интерпретировать данные. Без знаний о биологии возбудителей невозможно получить полезные для клиницистов результаты!

Диагностики
Эпидемиологического надзора
Обнаружения вспышек

Полностью охарактеризованный штамм:
видовая идентификация
серотип
сиквенс-тип (MLST)
cgMLST / wgMLST / SNP’ы
профиль антибиотикорезистентности
факторы вирулентности
другая информация, например,
- spa (S. aureus)
- emm (стрептококки группы А)

молекулярной генетики (д.б.н., профессор Д.Ю. Трофимов) развиваем новое направление – использование NGS для решения следующих задач:

Изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов.
Типирование госпитальных штаммов микроорганизмов.
Изучение микробиоты.

отдыха и международного туризма. Приморский район города Герцлия - «посёлок миллионеров». Это самая интересная часть города, которая считается «Силиконовой долиной» Израиля. Именно здесь вы найдёте чудесный пляж, шикарную набережную с множеством отелей и ресторанов, элитную частную больницу Герцлия Медикал Центр, а также это один из самых престижных, комфортабельных и дорогих жилых районов Израиля.» (Википедия)