Методы лал-теста. (Часть 3) презентация

Содержание

Признанные методы ЛАЛ-теста Гель-тромб Полуколичественный гель-тромб Хромогенный Турбидиметрический Кинетический хромогенный Кинетический турбидиметрический

Слайд 1Методы ЛАЛ-теста
Часть 3

Слайд 2Признанные методы ЛАЛ-теста
Гель-тромб
Полуколичественный гель-тромб
Хромогенный
Турбидиметрический
Кинетический хромогенный
Кинетический турбидиметрический

Слайд 3Какой метод лучше?
У каждого метода есть свои преимущества
Выбор метода зависит от:
Требуемого

результата
количественный
полуколичественный
Имеющегося в наличии оборудования
Типа образца

Слайд 4Выбор метода
У каждого метода свое назначение
Для выбора метода необходимо оценить тип

и объемы тестирования
В некоторых случаях имеет смысл применять более одного метода, например, для тестирования воды – кинетический хромогенный и кинетический турбидиметрический

Слайд 5Механизм реакции
Образование геля и турбидиметрический тип
ИЛИ
Хромогенный тип

Слайд 6Гель-тромб метод
Механизм и суть метода

Слайд 7Лизат амебоцитов Limulus Гель-тромб метод
Профермент
Активный
фермент
Эндотоксин
Коагулянт
Свертывающийся белок
+ (фрагмент)
Активный
фермент
Свертывающийся белок
Образование геля
Электростатические

связи

Слайд 8Постановка гель-тромб теста
Шаг за шагом

Слайд 9Подготовка образцов и правильное разведение, дозирование в пробирки

Слайд 10Приготовьте стандарт или серии стандартов и дозируйте в пробирки

Слайд 11Добавьте положительные контроли

Слайд 12Восстановите ЛАЛ-реактив ЛАЛ-реагентной водой

Слайд 13Добавьте лизат в пробирки для постановки реакции

Слайд 14Поместите в инкубатор на 60 минут

Слайд 15Медленно переверните пробирку

Слайд 16Интерпретация результатов гель-тромб теста
Очень простой тест
Результат интерпретируется субъективно Следовательно, результат зависит от

лаборанта
Метод считается недорогим, однако все зависит от количества образцов
Наиболее доступный метод по начальным инвестициям

Слайд 17Возможные проблемы гель-тромб метода
Результаты считываются на-глаз после переворачивания пробирки вручную
На образование

геля влияют различные факторы
вибрация
pH
температура
другие белки
Трудоемкий метод для средних и больших партий
Трудоемкий для валидации продукта метод

Слайд 18

Заявленная чувствительность лизата=0.125 ЕЭ/мл
Допуск 0.25 ЕЭ/мл до 0.06 ЕЭ/мл
0.5 0.25 0.125 0.062

0.031

1

2

3

4

Образец

+ + +

+ + + +

Ср. геометрическое =Antilog ( 1 x Log (0.125) + 3 x Log (0.062)) /4


+ + + +

+ + + +

Пример гель-тромб метода для подтверждения заявленной чувствительности лизата

Слайд 19Виды гель-тромб метода
Два вида гель-тромб метода
предел
Полуколичественный
Предел
Дает ответ ДА/НЕТ при определенной

чувствительности реактива
Полуколичественный
Можно определить концентрацию эндотоксина в образце путем серии разведений

Слайд 20Методы конечной точки
Механизм и суть метода

Слайд 21Методы конечной точки
Теоретически существует два метода

Хромогенный метод конечной точки
Турбидиметрический метод

конечной точки

На практике применяется только хромогенный метод конечной точки

Слайд 22Хромогенный метод конечной точки
Первый разработанный количественный метод

Диапазон чувствительности зависит от времени

инкубирования
Типичный диапазон: 1.0 ЕЭ/мл до 0.1 ЕЭ/мл
Расширенный диапазон:0.1 ЕЭ/мл до 0.01 ЕЭ/мл

Линейная зависимость от уровня эндотоксинов
Пониженная чувствительность к интерферентным факторам благодаря применению хромогенного субстрата

Слайд 23Замещение хромогенным субстратом коагулянта

Слайд 24Постановка хромогенного теста конечной точки
Шаг за шагом

Слайд 25Дозируйте стандарт и образец

Слайд 26Добавьте 50 μл лизата и инкубируйте

Слайд 27Добавьте 100μл субстрата и инкубируйте

Слайд 28Добавьте 100 μл реактива для остановки реакции

Слайд 29Результаты считываются через 405 нм фильтр

Слайд 30Характеристики хромогенного метода конечной точки
Требует многоразового добавления реактивов

Добавить лизат в стандарт

и образец и инкубировать
Добавить субстрат и инкубировать
Добавить реактив для остановки реакции (10% уксусная кислота или 10% SDS)
Считывание результатов на волне 405 нм
Соответствие температуры инкубации (37oC) является критичным фактором

Слайд 31ЛАЛ тест хромогенный конечной точки
Профермент
Активный
фермент
Эндотоксин
Хромогенный
субстрат
Высвобождение PNA
+ (фрагмент)
Активный
фермент
Концентрация PNA
(Желтый цвет)
Концентрации
эндотоксина
Прямая зависимость

от

Слайд 32Хромогенный тест конечной точки


Слайд 33Оценка хромогенного теста конечной точки
Дает количественный результат, интерпретация результатов объективная, результаты

стабильны в течение 30 мин

Хромогенный субстрат снижает влияние интерферентных факторов

Трудоемкий процесс, в ходе которого возможны ошибки оператора

Процесс можно автоматизировать

Слайд 34Возможные проблемы хромогенного метода конечной точки
Короткое время инкубирования обусловливает сложность поддержания

равномерности поддержания температуры микропланшет

Узкий диапазон может требовать дополнительных разведений для получения результатов

Трудоемкий метод

Реагент для остановки реакции может вызвать выпадение осадка

Слайд 35Кинетические методы
Механизм и суть методов

Слайд 36Кинетические методы
Наиболее недавние методы

Наиболее объективные методы

Два вида кинетических методов

Кинетический турбидиметрический
Кинетический хромогенный

Слайд 37Кинетический турбидиметрический метод
Первый из разработанных кинетических методов

Широкий стандартный диапазон
10.0-0.01 ЕЭ/мл

Первые методики

были неточными на всем диапазоне измерений

Современные реактивы дают меньшую погрешность

Слайд 38Кинетический турбидиметрический метод
Добавление реактива только один раз

Добавить реактив в стандарт
Добавить

положительные контроли продукта (обычно по 10 μл)
Подогрейте планшет
Добавьте лизат и начните тест
Определите результаты

Микропланшеты также требуют обработки в шейкере

Слайд 39Кинетический турбидиметрический ЛАЛ-метод
Профермент
Активный
фермент
Эндотоксин
Коагулянт
Свертывающийся белок
+ (фрагмент)
Активный
фермент
Свертывающийся белок
Образование
мутности
Электростатические связи

Слайд 40Кинетический турбидиметрический метод
Более быстрый метод, чем количественный конечной точки
Широкий диапазон
Очень хорошо

подходит для тестирования воды, но могут быть сложности с концентрированными сложными продуктами
Менее дорогостоящие реагенты, чем для кинетического хромогенного метода
Менее стабильный в процессе исполнения метод, чем кинетический хромогенный метод

Слайд 41Кинетический турбидиметрический метод – возможные трудности
Слабое отношение сигнал-шум, наличие пузырьков могут

затруднять анализ
Влияние таких же интерферентных факторов как и для гель-тромб теста:
вибрация
pH
температура
другие белки
Наличие пузырьков может затруднить анализ
Не подходит для вязких и мутных продуктов

Слайд 42Кинетический хромогенный метод
Наиболее поздний из кинетических методов вследствие трудности создания комбинированного

реактива
Лизат и синтетический субстрат

Отличное отношение сигнал-шум по сравнению с турбидиметрическим методом
Кинетический хромогенный - Delta OD 200 milliOD
Кинетический турбидиметрический - Delta OD 30 milliOD

Менее подвержен влиянию интерферентных факторов

Слайд 43Кинетический хромогенный метод
Широкий стандартный диапазон
До 4 log диапазона (50-0.005 ЕЭ/мл)

Реактив добавляется

один раз, что минимизирует вероятность ошибки оператора
Применение синтетического субстрата облегчает валидацию комплексных продуктов

Позволяет анализировать мутные и вязкие образцы

Слайд 44Проведение кинетического хромогенного метода
Шаг за шагом

Слайд 45Дозируйте стандарты и образцы

Слайд 46Добавьте положительный контроль продукта (ПКП)
Pre-warm the Plate in the incubating reader

for 10 minutes

Слайд 47Добавьте лизат и начните анализ

Слайд 48Планшет инкубируется, показания считываются каждые 150 секунд

Слайд 49Готовый анализ
Примечание: KQCL легко справляется с сильно окрашенными образцами, например, метиленовый

синий

Слайд 50Кинетический хромогенный метод
Реагент добавляется только один раз

Дозируйте стандарты и образцы
Добавьте положительный

контроль продукта (как правило по 10 μл)
Подогрейте планшет
Добавьте лизат и начните анализ
Collect Results

Микропланшеты также требуют обработки в шейкере

Слайд 51Кинетический хромогенный метод ЛАЛ
Профермент
Активный
фермент
Эндотоксин
Хромогенный
субстрат
Высвобождение PNA
+ (фрагмент)
Активный
фермент
Концентрация PNA
(желтый цвет)
Концентрация
Эндотоксина
Прямо пропорциональна

Слайд 52Суть кинетического хромогенного метода
В начале теста считывается оптическая плотность
Результаты первого считывания

принимаются за базовую линию – цвет, прозрачность, др.
Прибор измеряет оптическую плотность через фиксированные промежутки времени и определяет изменение оптической плотности на OD 30 для кинетического турбидиметрического и OD 200 для кинетического хромогенного метода
Анализ считается завершенным когда достигается нижняя стандартная точка

Слайд 53Кинетическая ЛАЛ реакция

Слайд 54Кинетическая хромогенная реакция
Время затраченное на достижение точки 200 mOD зависит от

концентрации эндотоксина
Для создания стандартной кривой используется стандарт
Т.к. результаты теста носят нелинейный характер, для создания стандартной кривой необходимо производить log-log преобразования

Слайд 55Slope = -0.204
Y-Int = 3.058
R = -0.998
Зависимость времени реакции от концентрации

эндотоксина


Слайд 56Кинетические методы
Нестандартная кинетика ферментов дает нелинейные результаты

Первоначальные методы не принимали в

расчет данную особенность
Новые методы вносят соответствующие коррективы

Слайд 57Кинетика реакции
Классическая кинетика Michaelis Menton
При определенных условиях скорость ферментной реакции

линейно зависит от исходной концентрации фермента
Изменение абсорбции в течение времени находится в линейной зависимости от концентрации эндотоксина

Слайд 58Кинетика реакции
Но не все ферментные реакции носят линейный характер
Кинетические ЛАЛ

методы:
В начале анализа отсутствует активный фермент
Фермент образуется в результате присутствия эндотоксина и его реакции на первой стадии каскадной реакции

Слайд 59Что измеряется?
Реальные измерения учитывают время задержки до появления фермента
Зависимость этой задержки

или времени реакции и концентрацией эндотоксина нелинейная

Слайд 60Типичные данные кинетического ЛАЛ анализа (линейный вид)

Слайд 61Линейные кинетические результаты
Такие данные не могут применяться для анализа неизвестных, в

особенности с применением линейной регрессии
Как можно линеаризировать данные?
По предыдущим данным можно сократить диапазон

Слайд 62Reaction Times vs Endotoxin Concentrations
Кинетический ЛАЛ-анализ

Слайд 63Кинетические данные
Сокращение диапазона не улучшает форму кривой

Шаг 1: Log ось эндотоксина
Расширение

интервала малых значений
Сокращение интервала высоких значений


Слайд 64Reaction Times vs Endotoxin Concentrations
Кинетический ЛАЛ - 1 Log

Слайд 65Кинетические результаты
Одноразовое логарифмирование недостаточно для улучшения стандартной кривой

Следующий шаг:
Log ось времени

(ось Y)

По-новому нанесите кривую

Слайд 66Кинетический ЛАЛ, Log-Log преобразование
Reaction Times vs Endotoxin Concentrations

Слайд 67Кинетические результаты
Практически линейные

Но не совсем

На примере видно корреляционный коэффициент -0.997

Тем не

менее, наблюдается отклонение

Это может привести к неточностям при определении неизвестных

Слайд 68Линейная регрессия метод наименьших квадратов

Слайд 69Линейная регрессия – Восстановление исходных значений
Method of Least Squares

Слайд 70Источник неточностей
Самое большое отклонение зачастую находится в середине линии регрессии

В этой

точке как правило проявляется положительный контроль
Влияет на расчет ЕЭ для различных разведений одного образца

Слайд 71Альтернативные методы расчетов
В идеале нужно придать кривой форму регрессионной линии
Формула линейной

регрессии
Y=A+BX
Определения уравнения
Расширенный анализ включает 4 определения………..

Слайд 72PowercurveTM
PowercurveTM is a patented controlled fit method which prevents ‘wrapping’
Y=A+B(X)+C(X2)+D(X3)E(X4)

Слайд 73Аппроксимация полиномной кривой
Аппроксимация полиномной кривой широко применяется в клинических исследованиях
В данном

методе есть потенциальная проблема – если не достаточно жестко контролировать расчеты, то кривую можно «подогнать» под любые результаты!!

Слайд 74Неконтролируемая полиномная аппроксимация

Слайд 75Power кривая
Линейная регрессия
Сравнение показателей точности

Слайд 76Power Curve
Power Curve признана контролирующими органами

Улучшает точность результатов

Сниженное количество повторений теста

Устраняет

проблему плавающих значений при разведении образца

Слайд 77Обзор методов
Выбор метода зависит от:

Количества образцов
Типа образцов
Доступного оборудования
или
Бюджет
Необходимость количественных результатов

Слайд 78……………
Как будут развиваться методики?
Человеческий фактор будет присутствовать и в дальнейшем
Данную проблему

могут решить только роботы
В 1998 BioWhittaker представил на рынок автоматический AutoLAL

Слайд 79AutoLAL
Сочетание системы дозирования жидкостей Beckman Biomek и ридера Biotek и программного

обеспечения BioWhittaker
Автоматическое приготовление
стандарта и образца
Автоматическое дозирование
образцов, стандартов
и положительных контролей
Автоматическое добавление
лизата, инкубирование и
чтение результатов

Слайд 80Преимущества AutoLAL
Сниженное количество ручного труда
Сниженное количество повторений
Улучшенная воспроизводимость
Отсутствие отклонений при
Работе разных

операторов

Похожие презентации

Опухоли и инфекционные гранулемы верхних дыхательных путей и уха 1182
Рак молочной железы: Факторы риска 298
Анализ Пани аптеки и конкурентов 331
Микробиологическая диагностика заболеваний, передающихся половым путем (ИППП) 716
Геморрагиялық васкулит 647
Дезинфекция рук 1143

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое ThePresentation.ru?

Это сайт презентаций, докладов, проектов, шаблонов в формате PowerPoint. Мы помогаем школьникам, студентам, учителям, преподавателям хранить и обмениваться учебными материалами с другими пользователями.

Для правообладателей

Яндекс.Метрика