Иммуноферментный анализ презентация

для качественного и количественного определения антигенов/ антител в биологических образцах. ИФА

ИФА - основан на специфическом связывании антигена (АГ) с соответствующими антителами(АТ) с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Главный принцип ИФА – «узнавание» анализируемого соединения специфическим к нему антителом.

Энгвалл и Р. Пэлман (Швеция), 1971 г.

а также любое соединение (аналит) к которому можно подобрать моноклональное антитело (Ат).
Эпитоп (антигенная детерминанта) – участок Аг, который узнается и связывается Ат.

Антитела:
1. Поликлональные (for example кроличьи антитела против всех Ig человека);
2. Моноклональные (к определенному классу Ig)

Основные характеристики антител:
Аффинность – степень специфического сродства активного центра АТ к АГ-детерминанте. При низкой афинности антител распад комплекса Аг-Ат приводит к удалению связанного Аг из системы.
Авидность – степень прочности связывания АТ с АГ.

Чем выше аффинность (степень сродства), тем лучше авидность (прочность связывания)

АГ и/или специфических АТ к ним;
Кардиомаркеры (hs СРБ, тропонин, миоглобин, NTproBNP);
Определение уровня гормонов (щитовидной железы, надпочечников, половые и т.д.);
Выявление и определение уровня ксенобиотиков (лекарственных препаратов, токсикантов, наркотических веществ);
Определение уровня иммуноглобулинов (Ig A, М,G, Е, подклассы IgG 1-4);
Определение уровня цитокинов (все IL,интерфероны, ФНО, КСФ и т.д.);
Выявление иммунных комплексов;
Определение уровня опухолевых маркеров (ОМ);
Определение уровня специфических белков крови (ферритин, TRF, фибронектин , эритропоэтин и др.);
Определение концентрации ферментов (СОД, глутатионпероксидаза, каталаза и т.д.);
Скрининг моноклональных антител;
Определение компонентов костного метаболизма (маркеров остеосинтеза и резорбции – (ДПД, С-концевые телопептиды, остеокальцин и т.д.)
Определение факторов свертывания крови (Д-димер)

Области применения ИФА

разделения иммунохимических комплексов, образовавшихся в процессе реакции от компонентов не вступивших в реакцию. Т.е. все реакции протекают в растворе;

Гетерогенный - реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности (твердой фазе) с иммобилизованными на нее АТ (или АГ).

Варианты ИФА

на первом этапе:
конкурентный
неконкурентный

В- «сэндвич»

реагент)

и коньюгат)

вещества в сыворотке (плазме) крови;
Измеряется в единицах концентрации.
Зависит от концентрации, активности и специфичности используемых Ат.
Специфичность – характеристика избирательности тест-системы.
Она показывает насколько вероятно, что реакция будет протекать с искомым веществом, а не с другими компонентами исследуемого образца.
Измеряется в %.

Чувствительность и специфичность ИФА повышается при применении моноклональных Ат.

на дне которого сорбированы Ат к искомому аналиту (Аг);

2. Инкубация при определенных условиях
происходит узнавание тестируемого соединения специфическим к нему Ат/Аг, что ведет к образованию иммунного комплекса;

3. Промывка лунок - удаление несвязавшихся компонентов реакции;

4. Внесение коньюгата – Ат/Аг меченые ферментом;

5. Инкубация
формируется связь коньюгата с ранее сформировавшимся иммунным комплексом;
Коньюгат - фермент-Аг (или фермент- Ат)

6. Промывка лунок - удаление несвязавшихся компонентов реакции;

сигнал

9. Внесение стоп-раствора;

10. Учет результатов с помощью спектрофотометра или ИФА-ридера.

стандартные образцы (калибровочные пробы),
каждый из которых содержит
исследуемый аналит в
определенной концентрации
По ОП стандартов строится
калибровочная кривая, на
которую затем накладываются



ОП растворов в лунках и определяется концентрация аналита в биологических образцах и контрольной сыворотке.
О правильности полученных результатов судят по результатам тестирования контрольных образцов (средняя, SD).

крови, остановке кровотечений при повреждениях стенок сосудов и растворении тромбов, выполнивших свою функцию в процессе свертывания крови.

Свертывание крови – сложная цепь реакций, в которых участвуют сосудистая стенка, тромбоциты и факторы свертывания.

ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ГЕМОСТАЗЕ

протромбиназ (тканевой + кровяной) - 3-4 мин;
2. Образование тромбина;
3. Образование фибрина;
4. Полимеризация фибрина и организация сгустка;
5. Фибринолиз - лизис фибринового сгустка, который приводит к растворению тромба после репарации поврежденной стенки сосуда.
.

активированный ф. Стьюард-Прауэр – основной компонент протромбиназы;
Va – активированный проакцелерин – ускоритель ферментативных реакций свертывания

Протромбиназа (комплекс факторов)

Тромбопластин (III) – Ca2+ (IV) - Xa – Va

и тромбоцитах, обеспечивающих свёртывание крови:
Плазменные (17 ф.) - I - XIII;
Тромбоцитарные (14-22 ф.);
Тканевые факторы;
Клеточные (эритроциты, лейкоциты)

Плазменные факторы свертывания преимущественно синтезируются в печени. Ф. VIII – в клетках эндотелия

Большинство факторов свёртывания — белки (ферменты, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов). Ca 2+ и др. низкомолекулярные органические вещества.

В норме белковые факторы свёртывания крови находятся в плазме в неактивном состоянии. В процессе свертывания крови предшественники факторов свертывания превращаются в их активные формы.

факторы V VIII, фактор Фицджеральда);

II:
Группа ф/г (I, V, VIII, XIII);
Группа протромбина (II, VII, IX, X);
Контактные факторы (XI, XII, прекалликреин, кининоген)

Механизм: адгезия, активация и агрегация тромбоцитов на обнажившихся в результате повреждения коллагеновых волокнах сосудистой стенки.

В результате образуется «белый тромб» (тромб с преобладанием тромбоцитов.

I ЭТАП СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

и тромбоцитарный рецептор гликопротеид Ib;

Активация тромбоцитов;

3. А. тромбоциты выделяют факторы (АДФ, тромбоксан), которые активируют другие тромбоциты;
4. А. тромбоциты выделяют ф. V (акцелератор плазменного каскада)

БАВ тромбоцитов (серотонин, тромбоксан)
приводит к:
- сокращению кровотока через поврежденный участок;
- стимуляции агрегации тромбоцитов;
- контактной активации свертывания с дальнейшим запуском ферментативных реакций вторичного гемостаза (плазменного)

размеров и степени зрелости тромбоцитов (ОАК);
Определение агрегационной функции тромбоцитов;
Определение ф. Виллебранда;
Определение ретракции кровяного сгустка.

Секундомер.

Продолжительность кровотечения (в норме) - 2 - 4 мин.

активированный ф. Стьюард-Прауэр – основной компонент протромбиназы;
Va – активированный проакцелерин – ускоритель ферментативных реакций свертывания

Протромбиназа (комплекс факторов)

Тромбопластин (III) – Ca2+ (IV) - Xa – Va

парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АЧТВ)
Тромбиновое время
Фибриноген
Продукты деградации фибрина (ПДФ)
Д-димер

отношение (ПО)
ПО = ПВ пациента/ПВ контрольной плазмы
(в норме 0,9-1,3);
3) Протромбин (по Квику) – определяется по калибровочному графику, построенному на нормальной плазме;
4) Международное нормализированное отношение (МНО) = (ПВ пациента/ПВ контроля x МИЧ*
Референсное значение 0,9-1,3

*МИЧ – международный индекс чувствительности

хирургические вмешательства, атеросклероз, инфекции);
удлиняется:
– дефицит или аномалия факторов протромбинового комплекса (VII, X, V, II);
- прием непрямых антикоагулянтов (варфарин);
- болезни печени;
- дефицит витамина К;
- ДВС в фазе гипокоагуляции

сек

Укорочение АЧТВ:
- при активации внутреннего механизма свертывания (тромбозы)
- ДВС (фаза гиперкоагуляции).
Удлинение:
– дефицит факторов внутреннего пути свертывания (VIII, IX, XI, XII) если результаты ПВ являются нормальными;
дефицит II, V, X при гипокоагуляции по результатам ПВ;
дефицит фактора Виллебранда;
ДВС (фаза гипокоагуляции)
заболевания печени
дефицит витамина К

пропорциональна активности фибринолиза (количеству лизируемого фибрина).

Методы определения:
Одностадийный ИФА.
Специфичность анализа обеспечивается использованием моноклональных антител, обладающих высокой специфичностью к D-димеру.
Нормальная концентрация D-димера в крови 0 - 250 нг/мл.

ценрта по Контролю заболеваемости США, 1998)

Дети грудного (0-12 мес.) и младшего (1-5 лет) возраста:
Грудное вскармливание или питательные смеси обогащенные Fe;
прикорм в виде фруктов, овощей и соков по достижению 6-месячного возраста;
Обследование для выявление анемии каждые 6 месяцев.
Дети младшего школьного возраста (5-12 лет) и мальчики-подростки (12-18 лет):
Обследование детей с ЖДА или недостаточным потреблением Fe в анамнезе;
Девочки-подростки (12-18 лет) и женщины детородного возраста вне периода беременности:
Потребление богатой Fe пищи и продуктов, усиливающих его всасывание;
Обследование каждые 5-10 лет на протяжении всего детородного периода;

анемию при первом посещении женской консультации;
При уровне Hg < 90 г/л обеспечить последующее наблюдение;

Послеродовой период:
Факторы риска включают длительную анемию, большую кровопотерю и многоплодную беременность;

Мужчины старше 18 лет и женщины в постменопаузе:
Плановое обследование не показано.

дети в возрасте до 1 года - до 45%.

(гемоглобин, миоглобин);

окислительно-восстановительные реакции (цитохромы, пероксидаза, каталаза);

транспорт и депонирование железа (трансферрин, ферритин, гемосидерин)

мг/кг – ферритина и гемосидерина;

Остальное – в составе гемсодержащих и др. ферментов.

Содержание Fe в белках организма

два центра связывания (2 атома Fe2+).
Биологическая роль – связывает и переносит Fe в эритрокариоциты костного мозга или в органы-депо Fe (печень и т.д.)

Ферритин – высокомолекулярный водорастворимый белок (500 кДа), содержит 20% Fe3+. Содержится практически во всех клетках организма, в большей степени - в селезенке, печени, костном мозге.
Биологическая роль – депо Fe.

Гемосидерин - небелковый комплекс нерастворимым в H2O и очень богатый Fe (37%). Содержится главным образом в макрофагах РЭС печени и селезенки.
Биологическая роль – изучена недостаточно.

в органах ЖКТ;
Эритропоэзом;
Депонированием железа;
Потерями железа.

- 0,6-0,7 мг/сутки;
через почки - до 0,1 мг/сутки;
менструации у женщин - от 0,6-1,2 мг до 2,5 мг железа /сутки. Всего за цикл 2 - 79 мг;
выделение через кожу (пот) - 0,2-0,3 мг/сутки
Нерегулярные потери - беременность и лактация.

максимальное количество Fe, которое может присоединить трансферрин (TRF);

коэффициент насыщения TRF = сыв. Fe/ ОЖСС;
Концентрация ферритина;
Концентрация трансферрина.

острыми инфекциями;
при заболеваниях органов ЖКТ;
Опухолях;
Инфаркте миокарда

гематокрит <39%.


Эритроциты <3,8 x109/л,
Hg <120,0 г/л,
гематокрит <36%.

снижением его количества в единице объема крови.

Непосредственной причиной является дефицит Fe в организме.

всасывания железа (хронический энтерит, резекция 12-перстной кишки и желудка)

дети в возрасте до 1 года - до 45%.

(синдром анемии).

крови (ОАК)

Hb>120 г/л
RBC, MCV, MCH, MCHC, RDW – НОРМА
2. Обмен железа:
СЫВОРОТОЧНОЕ ЖЕЛЕЗО - НОРМА ИЛИ СНИЖЕНО,
ТРАНСФЕРРИН - НОРМА
ФЕРРИТИН – СНИЖЕН

(гемоглобин) - < 120 г/л
RBC (эритроциты) - норма или снижены;
MCV (средний объем эритроцитов) - менее 80 fl;
MCH - менее 26 пг;
MCHC - менее 320 г/л;
RDW - > нормы. Норма 11,5-14,5%.

Hg в отдельном эритроците (концентрация гемоглобина / число эритроцитов);

MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроците (концентрация гемоглобина/гематокрит);
RDW - колебания объема клеток (коэффициент вариации среднего объема эритроцитов).

снижен;
ОЖСС - повышена;
Коэффициент насыщения трансферрина - снижен