Технология рекомбинантных ДНК. (Лекция 1) презентация

Что нужно для выделения гена?

• ДНК - источник гена

• вектор и подходящий хозяин

• средства расщепления ДНК –
рестриктазы

• инструмент для объединения
фрагментов – ДНК-лигаза

• способ введения векторной ДНК
в хозяина

• способ идентификации клонов

E. coli

«липкие» концы,
3’-overhang

«тупые» концы

(5’-конец длиннее)

(3’-конец длиннее)

Сайты расщепления двуспиральной ДНК
тремя разными рестриктазами второго типа:

невозможно пометить

Защита бактериального генома; метилирование; клонирование

концентрация агарозы

В геле присутствует бромистый этидий,
который интеркалирует в ДНК; комплекс
флюоресцирует при 590 нм.

при наличии уникальных сайтов
рестрикции для двух рестриктаз:

линейная форма плазмиды

фрагменты плазмиды

результат обработки
первой рестриктазой

ход гидролиза
второй рестриктазой

однонитевой разрыв
в случайном месте-
релаксированная форма

двунитевой разрыв
в случайном месте–
линейная форма

Электрофорез ДНК:
2. разделение по форме молекул

«вставка», содержащая ген

исходная
кольцевая
плазмида

обработка двумя рестриктазами

линейная ДНК с сайтами
рестрикции на концах

+

+ лигаза + АТФ

векторная ДНК, содержащая ген

«липкие» концы плазмиды

эфирная связь между концами
плазмиды уже не может
образоваться

лигирование возможно
только при участии
вставки

ДНК-лигаза

такая плазмида полностью
замкнется в кольцо уже в бактерии

р

выделение плазмидной ДНК
из отдельных колоний

проверка рестрикцией и определением
последовательности нуклеотидов

Размер вставки, которую могут переносить:

- плазмиды - до 10 тыс. пар оснований (п.о.)
- вирусы (фаги) - до 25 тыс. п.о.
- космиды - в среднем 45 тыс. п.о.
- бактериальные искусственные хромосомы – до 300 тыс.п.о.
- дрожжевые искусственные хромосомы - до 1 млн. п.о.

ген 1

ген 2

обратная транскрипция

двуспиральная
кДНК

деградация РНК

синтез второй цепи ДНК

транскрипция
сплайсинг – удаление интронов

выделение мРНК на
олиго-dT носителе

кДНК (cDNA) – комплементарная ДНК

В ядре

In vitro

ген 1

ген 2

Сравнение геномной и экспрессионной библиотек:

все равно из какой ткани выделена ДНК



представительство данного гена зависит от числа его копий в геноме

только малая часть генома млекопитающих кодирует белки (1,5% генома человека)

интроны сильно увеличивают размер вставок: ни бактерии, ни дрожжи не смогут осуществить сплайсинг

Активационный
домен

ген-репортер

ДНК

участок
связывания

транскрипция

белок-репортер

Метод основан на использовании одного из транскрипционных факторов дрожжевой клетки:

Связываясь с ДНК, фактор активирует транскрипцию гена, кодирующего белок, присутствие которого легко обнаружить

При наличии специфического взаимодействия в колониях-клонах обнаруживается белок-репортер:

колонии дрожжей, содержащие
белок-репортер, изолируют для
выделения ДНК и идентификации
партнера

кДНК из экспрессионной библиотеки встраивают
в нитевидный фаг (M13, fd) в область гена, кодирующего также белок его оболочки

инфекция в бактерии

размножение фагов

секреция фагов из клеток

суспензия фаговых частиц, несущих на
поверхности белки библиотеки, слитые с
белком оболочки (фьюжн-белки)

отжиг с РНК

гибридные молекулы

молекулы мРНК разделяются электрофорезом
и переносятся на мембрану

мембрана затем инкубируется с ДНК-пробой, меченной
радиоактивным фосфором или флюорохромом

Сродство к (стрепт)авидину.

Их ковалентно сшивают с

- в бактериальной колонии:

- или в препарате ДНК:
так же, как при Northern
гибридизации

мембрана

реплика

лизис бактерий, фиксирование и
денатурация ДНК

инкубация с меченой пробой

проявление автографа

Сравнительный анализ экспрессии генов

анализ флюоресценции
отдельных пятен

смесь равных количеств двух препаратов

гибридизация in situ

отжиг при 40-60º

ген

плавление при 94º

олигонуклеотиды, комплементарные
началу и концу гена (праймеры)
в большом молярном избытке

+

матрица

полимеризация при 72º

+

исходная матрица +
1 копия гена
(21 копии)

исходная матрица + 7 копий гена
(23 копий)

специальные праймеры:

начало рамки

конец рамки

цикл 1

цикл 2

28 циклов реакции

кодирующая последовательность с тупыми концами

кодирующая последовательность с липкими концами

PCR #1

PCR #2

удаление праймеров,
денатурация и ренатурация

P1

P2

PCR с праймерами P1 и P2

достраивание 3’-концов

г

бактерии из отдельных колоний

Master Mix: нуклеотиды, Taq-полимераза, буфер, праймеры

23 цикла реакции

электрофорез
ДНК

?

!

обычный цикл PCR

фиксированные на стекле
клетки с денатурированной
ДНК и РНК (формамид, 42º)

денатурация (75º)

гибридизация

метафазные хромосомы человека (мужчины)
гибридизовали с меченной
флюоресцеином (диоксифлюораном) пробой,
специфичной в отношении Х-хромосомы
(каталог “Molecular Probes”)

нормальный
дезоксирибонуклеотид

дидеоксирибонуклеотид-
терминатор полимеризации ДНК

одна из цепей ДНК отжигается
с праймером для инициации
полимеразной реакции

A

T

G

C

нуклеотиды-терминаторы

продукты реакций разделяются
по размеру электрофорезом в
полиакриламидном геле:

Каждый случай включения комплементарного нуклеотида сопровождается высвобождением пирофосфата (PPi) в эквимолярном количестве.

Пиросеквенирование. 454 Life Science

О

2

После того, как деградация закончена, добавляется следующий
dNTP и начинается новый цикл пиросеквенирования.

Секвенирование методом синтеза на матрице. Illumina

Фрагменты ssДНК закрепляют на твердой подложке
ДНК полимераза синтезирует комплементарную цепь
Встраивание каждого нового нуклеотида регистрируется
по флюоресценции

1. Фрагментация dsДНК
2. Два адаптера пришиваются ДНК-лигазой
3. Амплификация полученных фрагментов ДНК (ПЦР)

Включение первого основания

Удаление невключенных оснований

Детекция сигнала

Разблокирование синтеза, ферментативное удаление метки

Цикл 2:
Добавка реакционной смеси и повторение
цикла. Чтение второго нуклеотида

Последовательность ДНК определяется путем анализа всей совокупности данных, снятых с матрицы

Секвенирование методом синтеза

Секвенирование

20 microns

~1000 молекул на 1 µm кластер
~40 000 000 кластеров на один эксперимент
( цит. по Разину С.В., 2012)

                                                     5‘-atgcccaagctgaatagcgtagaggggttttcatcatttgaggacgatgtataa-3'  
1 atg ccc aag ctg aat agc gta gag ggg ttt tca tca ttt gag gac gat gta taa    M   P   K   L   N   S   V   E   G   F   S   S   F   E   D   D   V   *   
2  tgc cca agc tga ata gcg tag agg ggt ttt cat cat ttg agg acg atg tat     C   P   S   *   I   A   *   R   G   F   H   H   L   R   T   M   Y   
3   gcc caa gct gaa tag cgt aga ggg gtt ttc atc att tga gga cga tgt ata      A   Q   A   E   *   R   R   G   V   F   I   I   *   G   R   C   I   

Поиск открытой рамки считывания:

В неправильных рамках часто встречаются стоп-кодоны
(отмечены красной звездочкой)

6408 нукл. fd

Белок pVIII