Репродукция и дифференцировка клеток презентация

генетики А.П. Анисимов РЕПРОДУКЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК Часть I. Базовый уровень Конспект-презентация лекционного курса Владивосток 2017

на протяжении многих лет для студентов-биологов, специализирующихся по профилю «Клеточная биология». Не считая исторического введения, в нем есть три большие темы. Первая тема посвящена структуре и общим процессам митотического (клеточного) цикла; вторая – динамике пролиферативных процессов в онтогенезе, от первых делений зиготы до зрелых тканей с особенностями их кинетики и дифференцировки; в третьей теме рассматриваются молекулярно-генетические механизмы регуляции клеточного размножения и дифференцировки, представляющие сложную иерархию взаимодействий различных факторов – от средовых до генетических.
К настоящему времени по этим проблемам накоплен и продолжает расти огромный научный материал. Отразить его с достаточной полнотой в одном учебном (семестровом) пособии не представляется возможным, поэтому предлагаем настоящий спецкурс «Репродукция и дифференцировка клеток» лишь как «Часть I – Базовый уровень». Это означает, что без этих начальных знаний невозможно осваивать самые актуальные материалы по структуре и генетической мобильности хроматина, биологии и технологии стволовых клеток, регенерации тканей и органов, злокачественной трансформации клеток и другим проблемам, которые, как хотелось бы автору, должны быть отражены в Части II под условным названием «Актуальные проблемы». К сотрудничеству в этой сложной работе, а также к полезной критике данного пособия приглашаю специалистов.
В нашем пособии минимум текста, но достаточно иллюстраций, что обычно любят студенты, поскольку позволяет удовлетворительно усвоить на базовом уровне учебный материал. Учебное пособие могут использовать, кроме биологических цитологов, гистологов и эмбриологов, генетики, физиологи, биохимики, а также студенты биомедицинского профиля (лечебники, биофизики, биохимики) и другие специалисты, которым потребны современные знания в области клеточной биологии.

проблемы, до 1953 г.)

17 в. 1665 г. – Роберт Гук = открытие клеток у растений.
1671 г. – Грю, 1675 г. – Мальпиги = у животных.
До 19 в. Новых принципиальных положений не высказано.
Начало 19 в. = формируется клеточная теория:
1802 – Бриссо-Мирбе, 1809 – Ламарк, 1824 – Дютроше
= все организмы состоят из клеток.
1830 – Ян Пуркинье = описание клеточного ядра (зародышевый пузырек яйца курицы).
1831 – итальянец Роберт Броун = обнаружил ядро в растительной клетке.
Ввел термин nucleus. Идея о постоянном наличии ядра во всех клетках.
Роль ядра – неизвестна. (=Комочек слизи, питательные вещества ...).
1838-39 – Теодор Шванн (немецкий зоолог) = окончательная и наиболее полная формулировка клеточной теории.

Шлейдена об эндогенном цитогенезисе в форме «свободного клеткообразования» из недифференцированной бластемы:
= В слизистой массе зародыша (бластеме) образуются зернышки, вокруг которых конденсируется слизь и появляется оболочка – формируется цитобласт (=ядро).
Конденсация продолжается, образуется вторая оболочка – получается молодая клетка (=цит).
 




По Шванну, у животных
цитобластема находится
в межклеточном веществе.

(деление бластомеров раннего зародыша).
1832 – деление перегородками у нитчатых водорослей.
Но эти факты не принимались как универсальный способ клеткообразования. Поведение и роль ядра не понимали.
1847 – Горянинов (акад. Петербургской АН) допускал Шлейденовский цитогенезис для возникновения первых в эволюции клеток. Но в индивидуальном развитии признавал деление (перегородками, почкованием).
1841-1852 – Ремак. Его первые наблюдения –
деление клеток крови цыпленка.
Дал описание и обзор фактов по делению клеток и ядер перегородками и почкованием (позже Флемминг назвал такое деление амитозом). Утверждал, что это универсальное явление.
= Большой толчок к исследованию деления клеток.
1855-1859 – Рудольф Вирхов. «Целлюлярная патология».
Полностью развенчал теорию цитогенезиса Шлейдена, которая господствовала благодаря авторитету Шванна. Вирхов (1858): все клетки образуются путем деления! (Omnis cellula e cellulae!).

полной картины и объяснения не было. Накапливались отдельные сведения о поведении ядра, рисовали мета- и анафазы, не понимая сути.
1867 – Гофмейстер = наблюдал митоз у растений.

1873 – Шнейдер (зоолог) = первое описание последовательных картин митоза на дробящихся яйцах плоского червя. Это наблюдение осталось неизвестным для биологов.
1874 – Бючли = редукционное деление у нематод и улиток. Но по его заключению, ядро выталкивается из клетки, а новообразование ядер и клеток происходит из вакуолек и зернышек цитоплазмы, все от Шлейдена).
1876 – Ван Бенеден = открыл клеточный центр.

Клетки кожи саламандры, крупные хромосомы. Термины Флеминга: «митоз», «амитоз» (то, что рисовал Ремак), «хроматин» и др.

По Флеммингу: хроматин превращается в нити, идет продольное расщепление нитей и расхождение к полюсам. (термин «хромосома» позднее дал Вальдейер, 1883).

дробление у аскариды.
Но объяснения смысла продольного расщепления хромосом не было.
1883 – Вильгельм Ру, крупнейший биолог-теоретик: зернышки ядра соединяются в нити, они (зернышки) разнокачественные. Только продольное расщепление нитей обеспечивает равноценное разделение содержимого ядра по двум клеткам.
Это величайшая догадка и, по сути, теория митоза.
1884-85 – О. Гертвиг, Страсбургер, Рабль. Сформулирована гипотеза: ядро – носитель наследственности.
Открыт закон постоянства числа хромосом в соматических клетках одного биологического вида.
Эта идея наиболее развита Августом Вейсманом в его учении о зародышевой и соматической плазме.
Дальнейшее развитие этой концепции – вся теория гена Томаса Моргана. Оформление цитогенетики с хромосомной теорией наследственности (Сеттон, нач. 20 в.).
1896 – Э. Вильсон (американский цитолог). Первая капитальная сводка по цитологии и цитогенетике: «Клетка и ее роль в развитии и наследственности» (русский перевод 1936, 1940).

обнаружил новый класс органических соединений – нуклеопротеиды (из ядер лимфоцитов, гноя).
1872 – в ядрах спермы лосося обнаружены протамины и НК.
1889 – получены чистые НК, свободные от белка.
Однако в начале 20 в. наследственный материал связывали с белками.
Н. Кольцов = идея самоудвоения белков хромосом.
Лишь в 40-х годах выявлены различия ДНК (ТНК) и РНК и установлена их локализация (Фельген, Розенбек, Белозерский, Девидсон).
Возникло предположение о связи ДНК с хромосомами и ее роли в хранении и передаче наследственной информации.
1953 – Уотсон и Крик = расшифровка структуры ДНК и механизма репликации. Позже Крик = расшифровка генетического кода (ЦДМБ).
1953 – Говард и Пелк = сформулированы понятие митотического цикла.
Сошлись биохимические и цитологические работы. Начало современного этапа в изучении механизмов репродукции и дифференцировки клеток.
1953 – умер Сталин = начало освобождение генетики и цитологии в СССР от засилия лысенковщины.

клеток? Проблемы репродукции и дифференцировки клеток имеют междисциплинарное значение. Трудно найти другое направление, в котором так тесно переплетались бы интересы разных биологических и медицинских наук. При этом вопросы репродукции (размножения) и дифференцировки (специализации) клеток тесно взаимосвязаны между собой. Дифференцировка начинается «из-под» репродукции, в ходе митотических циклов. Рассматривая дифференцировку, исходим из клеточного цикла; изучая циклы, неизбежно выходим на дифференцировку.
Чьи же это проблемы?
Цитология (в узком смысле). Морфология митоза, цикл хромосом и др. клеточных структур, связь митоза и дифференцировки с клеточным метаболизмом.
Биология развития. Гаметогенез, в т.ч. специфический цикл мейоза. Репродукция и дифференцировка клеток как механизм эмбрионального морфогенеза (дробление, гаструляция, органогенез).
Гистология. Нормальный и репаративный гистогенез. Физиологическая регенерация (обновление) тканей и органов.

механизмов регуляции клеточной репродукции и дифференцировки такие дисциплины не состоятельны.
Онкология и радиобиология. Малигнизация (опухолевая трансформация) клеток. Именно задачи онкологии и радиобиологической защиты стали главным стимулом развития этих проблем в 50-60-е годы прошлого века и сохраняются по сей день. Задача: понять механизмы контроля, регуляции клеточного цикла, дифференцировки и смерти (апоптоза) клеток, чтобы ими управлять в патологических ситуациях.
Молекулярная биология и генетика. Регуляторы клеточного цикла и дифференцировки – молекулы, главным образом белки, кодируемые соответствующими генами (гены клеточного цикла и дифференцировки). Белковые регуляторы специфичны к тканевым клеткам-мишеням. Тут задействованы разнообразные гормоны, олигопептидные факторы роста, стимуляторы и ингибиторы, разнообразные молекулы-рецепторы, действующие в мембранах, цитоплазме и хромосомах на уровне сигналинга, активации транскрипции и трансляции. Ряд химических канцерогенов имеют сродство с регуляторами пролиферации (размножения) клеток. Открытие и изучение онкогенов и антионкогенов – молекулярно-генетическая проблема. Внутриклеточные сети молекулярного сигналинга – пути к управлению этими процессами.

ингибиторов репродукции и дифференцировки клеток.
Биотехнология. Клеточно-тканевая инженерия, заместительная терапия. Проблема стволовых клеток. Культивирование стволовых клеток, их искусственная детерминация и пересадка в организм, к больным органам. Выращивание тканей и органов in vitro.
Таким образом, проблемы репродукции и дифференцировки клеток – междисциплинарная область биологии, медицины, биотехнологии. Это область интересов синтетической науки – клеточной биологии.

цикла.
Корешки конского боба Vicia faba, меристема. Авторадиография с 35РО4.
РНК из препаратов экстрагировали, так что метка
получалась только от ДНК.
Показано, что синтез ДНК (редупликация хромосом)
происходит посреди интерфазы.
Рассчитаны параметры цикла: Т = 27 ч (реально 24 ч)
- время генерации, продолжительность цикла.
Выделены G1, S, G2, M – периоды (фазы) митотического цикла:
S – synthesis – синтетический; G1 – gap – пресинтетический, или постмитотический; G2 – постсинтетический, или премитотический; M – mitosis – митоз).
Определение митотического цикла:
Митотический цикл – циклическая последовательность взаимосвязанных и упорядоченных процессов, обеспечивающих подготовку к митотическому делению клетки и сам митоз.

(в реакции Фёльгена) по ходу митотического цикла. Использованы синхронизированные по циклу клеточные культуры.
Показано удвоение массы ДНК (от 2с до 4с) в середине интерфазы.
Т.о., графическое выражение МЦ возможно как кольцевое, так и линейное.

циклов в различных тканях животных и растений, в эмбриогенезах, при патологиях (онкогенез и др.).
Формируется новое направление – кинетика клеточных популяций.

Важнейшее новое открытие – обнаружение G0 – периода покоя – обратимого выхода из цикла.
Посреди G1-периода выявлена точка r (restrict point) – точка рестрикции (ограничения) возможностей (= check point – контрольная точка).
В это время решается судьба клетки:
1) в новый цикл на S-фазу;
2) в дифференцировку – работу – смерть (некроз, апоптоз);
3) в период покоя G0 до «особого распоряжения»;
4) в апоптоз – программированная смерть клетки.

Т.о., открылась новая идея для изучения регуляции клеточной репродукции и дифференцировки через r-точки (check points). Позднее подобные точки обнаружены по всему циклу.
Но – обо всем по порядку.

Включение в ДНК 14С- или 3Н-нуклеозидов (аденозин, тимидин и др.).
Тейлор (1957) впервые применил 3Н-тимидин. Простота и безопасность в
работе, высокое разрешение, точность локализации метки
(мелкозернистые ядерные фотоэмульсии с Ag+).
- Импульсная метка = оценка индекса меченых
S-фазных ядер (ИМЯ), 0-10-20-...-50…%.

ИМЯ=30%

- Насыщение меткой = оценка пролиферативного пула (Р), 0-100%.

клеток в дифференцировку, время жизни клеток, скорость обновления, направление миграции клеток.






- Учет % меченых митозов после введения 3Н-тимидина (Квастлер, Шерман, 1959) = графический метод определения параметров митотического цикла в асинхронной клеточной популяции (кривая меченых митозов).

В данном примере :
T = 10 ч
G2+1/2M = 2,5 ч
S = 3,7 ч
G1+1/2M =
T-S-(G2+1/2M) =
10-6,2 = 3,8 ч

на мазках, суспензиях или давленых препаратах. Цитофотометрический имидж-анализ содержания ДНК (от 2с до 4с) в отдельных ядрах (необходимо не менее 200-300 клеток на 1 пробу).
- Флюоресцентная микроскопия при окраске ДНК пропидиум-йодидом (PI) или ди-амино-фенил-индолом (DAPI). Проточная цитофлюорометрия суспензии клеток (оценивает до 10 тыс. клеток на 1 пробу).
= Оценка пропорции G1-, S-, G2-фазных клеток как критерий пролиферативной активности, быстрый анализ циклов в диагностике опухолей.

БДУ вводят живым клеткам на 30-60 мин.
Далее материал фиксируют и ядра окрашивают
антителами к БДУ на синтез ДНК (на фото желто-
зеленые) + PI или DAPI на содержание ДНК.
Флюоресцентная микроскопия, имидж-анализ.
Проточная цитофлюорометрия на включение
БДУ дает те же оценки, что при авторадиографии с 3Н-тимидином.
Кинетика клеточного цикла выявляется анализом S-фазного включения
БДУ в синтез ДНК в сочетании с фотометрией массы ДНК в течение цикла.

Н3 в комбинации с циклинами (белки-регуляторы цикла) или определением содержания ДНК в ядрах.
Фосфорилирование гистона Н3 в клеточном цикле – одно из характерных событий, происходящих во время митоза. Поэтому окраска на фосфо-Н3 выявляет только митозы. Применяют антитела к фосфо-Н3 (anti-H3-P) + антитела к циклину B1 или А + окраска на ДНК.

Флюоресценция клеток U-937, окрашенных anti-H3-P (антитела к фосфорилированному гистону Н3) с докраской аминоактино-мицином D на ДНК.
Антитела связываются только с митотическими хромосомами. Интерфазные ядра и апоптоз (стрелка) не метятся.

в М-фазе по отношению ко всем клеткам или другим фазам цикла (если сочетать с оценкой содержания ДНК):

получены в Кильском университете (Univ. of Kiel), Германия. 67 – номер удачного клона.
Сам белок Ki-67 – это антиген неясной локализации, связанный с пролиферацией; выявляется во всех активных фазах митотического цикла: G1, S, C2, M, но только не в G0.

= Проточная цитофлюорометрия оценивает общий пролиферативный пул и соотношение клеток в разных периодах цикла.

В нормальных (не опухолевых) клетках преобладает G0-период (по сути дифференцировка), хотя есть и циклирующие клетки. В опухоли G0-клетки практически отсутствуют, всё пролиферирует).

соответствующих антител.
PCNA – одна из субъединиц ДНК-полимеразного комплекса, поэтому anti-PCNA связывается только в S-фазных ядрах. Это – филогенетически древние (консервативные) молекулы. Имеют значительную гомологию у животных, дрожжей, растений.

= Проточная цитофлюорометрия выявляет в ядрах уровень экспрессии PCNA в сочетании с оценкой содержания ДНК (для определения фаз цикла) – фактически это S-фазный индекс (ИМЯ в авторадиографии с 3Н-тимидином).

запускается во 2-й половине G1-периода, после точки check point (точка r).
Для синтеза ДНК необходимо наличие 4 видов дезоксирибонуклеотидов (ДНтидов): тимидиловый ТТФ, адениловый АТФ, гуаниловый ГТФ и цитидиловый ЦТФ.
Метаболический фонд нуклеотидов невелик. В основном он состоит из рибонуклеозидов, которые и являются источником образования дезоксирибонуклеотидов.

Для этого происходит:
энзиматическое восстановление рибозы до дезоксирибозы: РНзиды преобразуются в ДНзиды;
и далее фосфорилирование: нуклеозиды переходят в нуклеотиды.

Требуется еще преобразование урацила в тимин.
Весь процесс включает:
1) энзиматическое восстановление рибозы до дезоксирибозы – РНзиды преобразуются в ДНзиды;
2) метилирование урацила – уридин превращается в тимидин;
3) фосфорилирование тимидина – нуклеозиды переходят в нуклеотиды.

имеются всегда в одинаковом количестве. Адениловая, гуаниловая и цитидиловая киназы имеются всегда, а тимидиловая киназа практически отсутствует в покоящихся клетках и появляется только в цикле, в короткий срок перед S-фазой.
С другой стороны, происходит катаболизм предшественников. Кислая фосфатаза способна дефосфорилировать ТМФ, выступая антагонистом киназы.
[Опыты с 3Н-тимидином. У земляной белки (низкая физиологическая активность) включение тимидина слабое, у золотистого хомячка (высокая активность) – сильное. Оказалось, что у белки резко увеличена активность ферментов катаболизма тимидина и др. нуклеотидов. Возможно, те же различия имеются у мидии и гребешка?].
Т.о., активность киназ тимидиловой системы и их антагонистов фосфатаз управляет пулом тимидинфосфатов и является лимитирующим фактором в подготовке к репликации ДНК. Синтез и распад нуклеотидов перед S-фазой – один из механизмов регуляции цикла (с помощью специальных киназ и циклинов, Глава 3).

способа ее репликации: консервативный, полуконсервативный, дисперсный.
 

 

При разработке модели строения и удвоения ДНК Уотсон и Крик исходили гипотетически из полуконсервативного принципа: разрыв водородных связей, расхождение цепей, достройка на них комплементарных цепей (в соответствии с правилом Чаргафа: А-Т, Г-Ц).
В результате каждая новая молекула ДНК должна иметь одну нить от исходной молекулы, а вторую вновь синтезированную.
Но метода доказательства не было. А уже появились наблюдения фрагментации ДНК, сестринских хроматидных обменов (СХО). Позднее СХО были определены как мутации, но сначала это могло свидетельствовать в пользу дисперсного механизма репликации ДНК.
Первые исследования выполнены изотопными методами.

мечение 3Н-тимидином S-фазы 1-го цикла. Отмывка и дальнейший рост (2-й цикл) без меченого тимидина.
Фиксация на митозы 1-го цикла (через 3-5 час.) и 2-го цикла (через сутки):





Первая волна митозов: во всех хромосомах мечены обе хроматиды.
Вторая волна митозов: в каждой хромосоме мечена только одна хроматида.
Эти данные объясняются только исходя из полуконсервативного принципа репликации:

хорошо красится по Гимза и флюоресцирует с Хёст-33258. Участки с включенным БДУ (вместо тимидина) плохо красятся и не флюоресцируют.
Клетки китайского хомячка культивировали in vitro в течение 2 поколений в среде с БДУ.
Хроматиды красились (и светились) по-разному:
- сильно крашенные – исходные, без метки БДУ,
- средне крашенные – с 1 БДУ-замещенной нитью ДНК,
- слабо крашенные – с 2 БДУ-замещенными нитями ДНК.

1957, 1958).
У бактерий одна кольцевая хромосома, упакованная в нуклеоид.
Удвоение ДНК происходит за 20-30 мин, и сразу наступает деление клетки.



Биохимический подход. Разработан метод равновесного центрифугирования в солевом растворе для разделения ДНК разной удельной плотности: легкая с 14N и тяжелая 15N.
E. coli выращивали 10 поколений на среде с 15NH4Cl. Практически весь азот заместился на тяжелый 15N.
Далее культура перенесена на среду с обычным 14NH4Cl. Начался синтез легкой ДНК.
В первом и втором циклах ДНК выделяли и центрифугировали.

с развертыванием нуклеоида и высвобождением ДНК на предметном стекле, фиксация и авторадиография через 5, 10, 20 ... мин от начала S-периода.
Наблюдали образование 2-го кольца ДНК по полуконсервативному механизму.

репликации ДНК:
- репликация начинается в определенной стартовой точке «О» (origin),
- репликация идет сразу в 2 направлениях (2 репликативные вилки) и заканчивается в точке «T» (terminal),
- вся хромосома – одна единица репликации, один репликон (то же самое показано у фага λ, вируса SV40).
Т.о., у прокариот и вирусов – монорепликонные хромосомы.

У эукариот все оказалось много сложнее.

3.3. Репликоны. Моно- и полирепликонные хромосомы.

(6х10-12 г) ДНК (6х109 пн).
то около 2 м, по 20-80 мм в отдельных хромосомах (сравни с 2 мм у E. сoli).
- Скорость репликации у эукариот (50 пн/сек) на порядок ниже, чем у прокариот (500 пн/сек). С такой скоростью при монорепликонной организации хромосом период синтеза ДНК длился бы сотни часов; на самом деле он занимает до 5-10 ч.
- Уже в ранних работах (Тейлор, 1960) показано, что импульсная метка 3Н-Т обнаруживается сразу во многих участках хромосомы. Особенно хорошо это видно на политенных хромосомах дрозофилы. Каждый диск (хромомер) – отдельный репликон?




Т.о., по длине хромосомы имеется множество точек инициации синтеза ДНК. Каждый автономно реплицирующийся участок– репликон. Хромосомы эукариот полирепликонные.

импульсно. Выделение ДНК на стекла, растягивание в нити. Авторадиография. Треки расположены тандемно (парами).
 
 







По разным расчетам длина одного репликона (расстояния между точками «о») варьировала от 10 до 250 мкм, что соответствовало от 5000 до 200 репликонам в средней хромосоме длиной 50 мм ДНК.
Так есть ли стандарт репликона, или они изменчивы?

(tS) на разных стадиях развития и в разных зачатках (органах) сильно меняется.
У саламандры: эмбриональные клетки ранней бластулы - tS = 1 ч;
дифференцированные взрослые клетки - tS = 48 ч;
премейотический синтез в сперматоцитах - tS = 200 ч.
У морского ежа: первые деления дробления - Т = 1,5-2 ч, tS = 0,8 ч;
поздняя гаструла - Т = 50-60 ч, tS = 25-30 ч.
У дрозофилы: первые циклы дробления - Т = 10 мин, tS = 3,5 мин !
(расчетная длина репликона = 3-4 мкм).
клеточная культура от взрослых мух - все на порядок больше.
Т.о., время S-фазы удлиняется от нескольких минут до нескольких часов.
При этом во всех случаях скорость движения репликативных вилок примерно одинаковая!
Следовательно, в ходе развития уменьшается число точек инициации и, соответственно, увеличивается длина репликонов. Большинство точек, активных на ранних стадиях, не используются (отключаются) на более поздних стадиях.

порядка (элементарные) : 0,7 мкм, различимы при ЭМ авторадиографии (соответствуют нуклеомерам хроматина).
Репликоны II порядка : 3 – 5 мкм, минимальные при светооптической авторадиографии (= часть петельного домена).
Репликон III порядка : 15 – 20 мкм, основной репликон с терминаторами (точки t); был известен как ARS – autonomously replicating sequences (= 2 половинки соседних петельных доменов хромонемы). В точках «о» находятся консенсусные последовательности из 11 нп: -АТТТАТАТТТА- .
Репликоны IV порядка : 150 – 200 мкм, самая крупная единица, 100-300 штук на хромосому (= один хромомер, или диск политенной хромосомы).

регистрируемых репликонов, соответственно, увеличивается.
Сначала, в раннем эмбриогенезе, включены все элементарные репликоны, потом по 1 точке в репликонах II порядка, далее III, IV.
Имеем сложный многоуровневый (иерархичный) механизм регуляции репликации ДНК. Иерархические уровни репликации ДНК отражают дискретность структурной организации хроматина.

дробления зиготы репликоны инициируются почти одновременно. В делящихся (стволовых) клетках взрослого организма соседние малые репликоны (I-II порядков) тоже синхронизированы (последовательное расположение тандемов).
 



 Но репликоны III-IV порядков инициируются асинхронно. Т.о., по длине хромосомы и при сравнении разных хромосом наблюдается асинхронность репликации ДНК.
Однако это не означает беспорядочности репликации. Время начала и окончания репликации в тех или иных хромосомах (график репликации) сохраняется неизменным в ряду клеточных делений. Каждая хромосома характеризуется высокой стабильностью порядка репликации, имеет специфический рисунок репликации.

начале S-периода (по: Захаров и др., 1982)

S-фазы реплицируется эухроматин, во второй – гетерохроматин (правило поздней репликации гетерохроматина). Lima-de-Faria (1959) впервые обнаружил это на сперматоцитах кузнечика: в гетерохроматической Х-хромосоме ДНК синтезировалась только в конце S-периода. То же выявлено в клетках растений, млекопитающих, моллюсков и др.
Распределение метки в хромосомах человека (46, ХХ) при включении 3Н-Т
в начале S-периода и в конце S-периода
(стрелкой показана Х-хромосома) (Захаров и др., 1982)

Так возникла проблема рано и поздно реплицирующейся ДНК.

участки остаются в конденсированном состоянии; различимы эухроматин и гетерохроматин (Heitz,1928). Гетерохроматин локализован в основном по периферии ядра. Brown (1966): гетерохроматин есть факультативный и структурный (конститутивный).
Факультативный гетерохроматин – не работающие конденсированные гены. Яркий пример – Х-хромосома (тельце Бара, половой хроматин) у млекопитающих и человека.
Структурный гетерохроматин – постоянно конденсированный в одних и тех же районах обеих гомологичных хромосом (теломерный, центромерный, интеркалярный, околоядрышковый). Образован разными видами сателлитной ДНК, многоповторными последовательностями нуклеотидов.
Оказалось, что правило Лима-де-Фария справедливо только для факультативного гетерохроматина, который действительно реплицируется в конце S-фазы.
СатДНК реплицируется на протяжении всего S-периода, причем каждая фракция имеет свой пик синтеза в определенной части S.
Пример: на 3 видах кенгуровых крыс выявляли время репликации разных фракций сатДНК:

идти в начале, середине или конце S-фазы;
- Хронология репликации видоспецифична;
- Распространенное представление о поздней репликации гетерохроматина справедливо только в отношении факультативного гетерохроматина.
- Эухроматиновая ДНК реплицируется преимущественно в первой половине S-фазы, но отдельные локусы реплицируются в середине и даже в конце S-фазы. Например, репликация ядрышковых организаторов:

NB: У хомячка и крысы гены рРНК (ЯОР) локализованы в 1 паре хромосом, у человека – в 5 парах. Каждая пара хромосом имеет свой график репликации.

(Босток, Самнер, 1981)

у разных видов и в разных тканях.
И все же есть доминирующая тенденция: высокая активность репликации в начале и ее снижение во 2-й половине S-периода.

На ряде объектов (культуры, регенерация печени, эмбрион морского ежа, корешки, водоросли, амебы) выявлено резкое снижение скорости репликации в середине S-фазы.
Эти пики S коррелируют с синтезом
новых РНК и белков, в том числе
гистонов, а перерыв
сопровождается усилением
активности ряда ферментов.
Два пика S связывают с синтезом
рано- и позднореплицируемой ДНК.
Это – отражение работы механизмов регуляции клеточного цикла.

клонирована и расшифрована у многих организмов:
- человек и другие позвоночные (более 100 видов): ……………………………….. (TTAGGG)n;
- беспозвоночные: та же или близкая последовательность;
- тетрахимена: …………………….. (TTGGGG)n;
- растения: …………………………… (TTTAGGG)n.
Число повторов (n) варьирует у разных видов: максимальное n у мыши – 100 тыс. нп, у обезьяны – 25 тыс. нп, у человека – 12 тыс. нп.
Но число повторов не одинаково и в разных типах клеток одного организма, например у человека в разных зрелых клетках n= 250-1500 нп.

образуются индуцированные концы хромосом, которые
деградируют или связываются с
другими хромосомами
(в митозе образуются мосты).
Предотвращают разрушение эухроматической (=генетической) части хромосомы при множественной репликации. Концы хромосом сокращаются в каждом цикле из-за недорепликации по последнему РНК-праймеру (по модели Оказаки). Сокращается теломерная (сателлитная!) ДНК, а геномная ДНК до поры до времени защищена.
За теломером имеется субтеломерный участок (другая сатДНК, разная у разных видов). Это дополнительный буфер между теломером и генами.
На этом построена теломерная гипотеза старения клеток (основана А.М. Оловниковым, 1970-е годы):
Соматические клетки при каждом делении теряют часть теломерных повторов, которые изначально защищают генетическую зону от укорочения (разрушения). Когда теломеры и субтеломеры израсходуются, разрушаются концевые гены, разрушаются хромосомы. Клетка погибает.

совсем невозможной. (Или ген отрывается в ходе диминуции хроматина?).
Не случайно в клетках разных типов хромосомы различаются по длине теломеров, а самые длинные «хвосты» обнаружены в генеративных клетках.
Т.о., бессмертие клеток в активности гена теломеразы! Ген выделен и клонирован. Введение его в старые клетки продлевает их размножение. Биотехнологическое значение.

Но в генеративных клетках (гониях, эмбриональных стволовых, раковых) экспрессируется РНК-содержащий фермент теломераза; ее РНК-фрагмент комплементарен сат-повтору ТТАГГГ.
Теломераза в каждом цикле достраивает недостающие последовательности нуклеотидов ДНК: сначала по 3’-концу с помощью своего РНК-фрагмента, а потом по 5’-концу с участием ДНК-полимеразы.

нарушения по азотистым основаниям или сахаро-фосфатному остову.
Ошибки – спонтанные (происходят при репликации или рекомбинации ДНК).
Нарушения – индуцированные (происходят под действием УФ света, R-лучей, химических веществ).

Но в клетке есть гены, обеспечивающие синтез не только реплицирующих, но и репарирующих ферментов. Обычно эти ферменты совмещены в ДНК-полимеразных комплексах.

флуктуации в структуре азотистых оснований, как матричных, так и присоединяемых.
Пример – обычные и необычные пары нуклеотидов, возникающие спонтанно из нестандартных (минорных) оснований:

составе ДНК-полимеразы Pol I) удаляет необычный нуклеотид. Т.о., уже в репликативной вилке, контролируется каждый новый нуклеотид. В случае мутации гена экзонуклеазы Pol I неправильные нуклеотиды не устраняются и закрепляются в форме новых мутаций.
В репарации и репликации участвуют также:
Pol II (заполняет пробелы между фрагментами Оказаки),
Pol III (ключевая полимераза по хромосомной ДНК E. coli),
ДНК-лигазы (соединяют цепи ДНК при репликации, репарации и рекомбинации),
топоизомеразы I и II (разрывы и сшивки на «острие» репликативной вилки – шарнир).
Нарушения (повреждения) – нарушения остова ДНК, модификации оснований или ошибочные спаривания оснований при рекомбинации (в ходе кроссинговера).
2-цепочечные повреждения в одном месте, в том числе 2-цепочечные разрывы, они всегда летальны. (Уникальное исключение – Т4-лигаза E. coli: при внедрении фага Т4 соединяет 2-цепочечные фрагменты на концах разрыва.)

Г) и до-рибозой (депуринизация ДНК). За сутки в 1 клетке может возникать 5-10 тыс. разрывов.
Результат – нарушение
репликации и экспрессии генов.

2. Спонтанное дезаминирование цитозина и аденина, с превращением их в урацил и гипоксантин (природное производное пуринов).
Частота – до 100 событий на геном за сутки.
 NB: Эти нарушения должны быть устранены до начала следующего раунда репликации, т.е. сразу в S-периоде, в G2-, M- или G1-периоде данного клеточного цикла. Иначе, в ходе новой репликации ДНК, 1-нитевое нарушение будет закреплено и во 2-й цепи. Это уже устойчивая мутация.

азотистые соединения, алкилсульфонаты, нитрозо-мочевина) производят метилирование оснований;
- разные агенты, вызывающие ковалентные сшивки между цепями ДНК.

2. Физические воздействия:
- УФ поглощается тимином и цитозином, что ведет к сшивкам между соседними пиримидинами в одной цепи;

- ионизирующая радиация (в том числе космические лучи) ведет к образованию реакционных свободных радикалов, оказывающих на ДНК разные повреждающие воздействия;
- медицинское R-облучение инициирует 1-2-нитевые разрывы и другие нарушения.

Прямое восстановление исходной структуры:
- специальные ферменты могут просто снимать метильные группы, полученные под действием алкилирующих агентов;
- ферменты фотолиазы (фотореактивирующие ферменты бактерий и низших эукариот) под действием видимого света превращают пиримидиновые димеры, полученные при УФ облучении, в нормальные мономеры.

вблизи или отрывает основание от до-рибозы;
(2) экзонуклеаза удаляет нуклеотид или целую группу, оставляя брешь;
(3) удаленный участок синтезируется заново с 3’-конца по целой цепи;
(4) ДНК-лигаза сшивает концы разрыва.
 
 

 

 
Могут использоваться и эндонуклеазы, например разнообразные AP-эндонуклеазы (апуриновые, апиримидиновые), где произошла депуринизация и депиримидинизация. Разрушается участок из нескольких нуклеотидов, потом он ресинтезируется.

нуклеотидов. Далее пробел заполняется с помощью полимеразы и лигазы:

или сохраняются в геномах потомков в форме мутаций.
Поврежденная ДНК еще более уязвима. Поэтому повреждения надо устранять.
Мутации по генам ферментов репарации – прямой путь к мутациям структурных генов, т.е. к разнообразным генетическим заболеваниям, включая онкологические .
В частности, у людей с пигментной ксеродермой нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК (мутация в 1 из 9 генов). Даже при слабом воздействии солнечного света развивается рак кожи.

сопровождается их ростом, примерно в 2 раза на цикл.
(Старое представление о «критической массе», необходимой для начала деления. Опыты с амебой: периодическое отрезание части цитоплазмы ведет к бесконечной задержке митоза.)
Исключения: дробление зиготы и некоторые специальные случаи.

В основе роста клетки лежат синтезы РНК и белков (транскрипция и трансляция генетической программы).

тРНК, рРНК (не считая регуляторных мяРНК).
Гены пре-иРНК (10-80s РНК) локализованы диффузно по эухроматину всех хромосом. Это уникальные или умеренно (10-20) повторенные последовательности; в геноме человека около 25 тыс. таких генов.
Пре-иРНК – подвергается процессингу и сплайсингу в перихроматиновых гранулах – информоферах (разрушается до 80-90 % интронной РНК). Готовая иРНК (сшитые экзонные фрагменты) выходит через ядерные поры в цитоплазму, связывается с новыми белками и образует информосомы.
Гены пре-тРНК (4s РНК) – локализованы так же диффузно; это умеренные повторы. В геноме 61 вид генов тРНК (по числу кодонов). Процессинг идет без сплайсинга.
Гены пре-рРНК (45s РНК) – локализованы в ядрышках (ЯОР, NOR), они присутствуют в фибриллярных центрах и фибриллярном компоненте ядрышка. Это 1 вид гена, он образует умеренные повторы. У человека до 500 повторов в 5 парах хромосом.
45s РНК процессирует без сплайсинга до 18s, 28s и 5,8s рРНК.
(5s рРНК синтезируется на других хромосомах).

распад уравновешены. Но при вступлении клетки в митотический цикл синтезы начинают преобладать, и общее содержание РНК увеличивается.
- Данные цитофотометрии: общая масса РНК или только рРНК в ходе интерфазы примерно удваивается.
- Морфологические данные: увеличение объема ядрышек в циклирующих клетках (регенерирующая печень, крипты кишечного эпителия и др.).
Динамика синтеза и процессинга РНК исследуется на синхронизированных клеточных культурах (или в асинхронных клеточных популяциях) при одновременном учете ДНК (фаза цикла) и РНК.
Оценивают включение в РНК 3Н-уридина или флуоресцентно меченного урацила (в форме УТФ), активность РНК-полимеразы I (ядрышковая), РНК-полимеразы-II (хроматиновая).

в том числе синтез РНК, идут в интерфазе;
(NB: понятие «синтетический период» интерфазы (S) – относится только к синтезу ДНК; все другие синтезы идут на протяжении всей интерфазы, хотя скорости изменяются.)
- Митоз – инертная, не активная фаза; синтез РНК прерывается от поздней профазы до ранней телофазы вследствие компактизации эухроматина;
- В интерфазе транскрипция прерывается только в реплицируемых участках хроматина (синтезы РНК и ДНК взаимоисключены в 1 пуфе политенной хромосомы).

Позже выявлено, что разные формы РНК имеют свои максимумы синтеза.

al. (1976). Культура клеток человека HeLa, синхронизированная по фазам цикла.
Импульсная метка 3Н-уридина, интервал проб – 1 час.
Суммарную РНК выделяли и фракционировали центрифугированием по скорости седиментации в градиенте сахарозы. Выделяли ядрышковые фракции РНК: 45s (первичный транскрипт), 32s (промежуточный процессинг), 28s и 18s (конечные рРНК формы).
Радиоактивность фракций РНК, отражающую скорость синтеза (45s) или процессинга (32s, 28s, 18s), оценивали сценциляционным счетчиком.
Результат:

после митоза), снижается в S и G2, прекращается в M.
Процессинг идет в 2 волны; на самом деле это 1 волна, прерванная митозом:
- ранний процессинг (в S-G2) дает первую партию рибосом, поздний процессинг (продолжение волны в G1) дает последнюю партию.
Синтез 45s РНК и ее процессинг (появление 32s, 18s, 28s РНК) разобщены во времени, каждый имеет свою динамику.

в суммарную РНК ядра или только в РНК хроматина (без ядрышка). Отсюда разнобой результатов.
Детальные исследования группы Pfeiffer (1968) на синхронизированной культуре HeLa, подтвержденные позже на других объектах (др. культуры, растения, инфузории, плесень).
Применяли 3Н-уридин импульсно (0,5-1 час) в разных точках цикла.
Результат:

оценки), но закономерно удваивается в первой половине S-периода.
В первой половине S проявляется эффект дозы генов – в связи с репликацией эухроматиновой ДНК (удвоение числа активно функционирующих генов). В разных типах клеток для этого требуется репликация 30-50 % ДНК ядра.
(Воздействие ингибиторами репликации ДНК подавляло рост синтеза РНК в S-периоде).

Надо учитывать:
Артефакты: несовершенство методик, плохая синхронизация цикла.
Различия клеток: степень их митотической потентности (стволовости), степень дифференцировки, т.е. разное соотношение ауто- и гетеросинтезов РНК.
Изменения активности РНК-полимераз или их поступления в ядро.
Колебания пула нуклеотидов – общих предшественников РНК и ДНК.
Возможность изменения проницаемости мембран и т.д. и т.п.

аминокислот: 3Н- или 14С- лейцин, глицин, пролин, метионин и др.
Радиоактивную метку регистрируют на микроскопических препаратах (авторадиография) или в выделенных белках (счетчиком).
Используют клеточные культуры, синхронизированные по фазам цикла.
Результаты по синтезу общих (суммарных) белков очень различаются в зависимости от типа клеток, их возраста, используемого предшественника и др. факторов.
Но есть и общие тенденции.

- в митозе синтез белка очень слабый (20 % от интерфазного максимума);
- в G1 синтез максимальный, в S – снижение, в G2 – второй максимум, но меньше первого.

Что бы это значило? Не противоречит ли это динамике синтеза иРНК с эффектом дозы генов в первой половине S-фазы?

Попробуем согласовать различные динамики (производство рибосом, транскрипция структурных генов – синтез иРНК, синтез беков) по максимальным проявлениям этих процессов.

один максимум, но временно прерывается в митозе.
Продолжительность одного синтетического цикла (синтеза РНК и суммарных белков) примерно в 1,5 раза длиннее митотических цикла, поэтому последовательные синтетические циклы перекрываются (довольно распространенная закономерность).

импульсно с интервалом 1 час., тубулин выявляем по специфическому связыванию с колхицином).
Динамика включения 3Н-лейцина в тубулины наводит на мысль о том, что этот белок максимально синтезируется непосредственно перед митозом (2-я половина S и весь G2-период) и сразу участвует в строительстве микротрубочек митотического веретена:

Однако мысль оказалась неверной. Проведем два проверочных теста.

меченым, но метятся митозы следующего цикла (М2).
Блокируем синтез тубулинов в G2-периоде с помощью пуромицина (антибиотик – блокатор синтеза белков). Ближайший митоз идет без остановки, но последующие митозы задерживаются в анафазе, значит митотическое веретено не организовано.
Реалный цикл синтеза тубулинов для микротрубочек веретена таков:










Синтез тубулинов для веретена митоза (М2) происходит в основном в интерфазе предыдущего митотического цикла (S – G2), а заканчивается в G1 – S нового цикла. В G2-периоде этого цикла идет лишь сборка тубулинов в микротрубочки веретена, но также начинается синтез тубулинов для веретена следующего митоза (М3) и т.д.

и заканчивается чуть позже), так что их количество примерно удваивается в S-периоде:









Таким образом, динамика синтеза индивидуальных белков (и их мРНК) мозаична.
Особый график у белков-регуляторов клеточного цикла – CD-киназ и их циклинов, но это отдельная тема.

цикл, формирование и работа веретена – центросомный цикл и разделение клеточного тела – цитокинетический цикл. Начнем с хромосомного цикла.
5.1. Концепция структурной непрерывности хромосом
В интерфазе клеточного цикла морфологически обособленные хромосомы не видны. Однако они здесь присутствуют в форме хроматина – в деконденсированном (декомпактизованном, деспирализованном) состоянии.
- В конденсированном состоянии (метаболически не активном), в процессе митоза, выполняется функция разделения генетического материала.
- В деконденсированном состоянии, в интерфазе, - функции репликации и транскрипции.
При этом каждая хромосома в цикле остается цельной непрерывной нитью, деконденсация происходит без разборки, без разрывов, а пространственная организация хроматина обеспечена связями с ядерным матриксом и ламиной ядерной оболочки.

сформулировал теорию индивидуальности и непрерывности хромосом: хромосомы после митоза сохраняются в ядре в качестве самостоятельных единиц, хотя и в измененном виде, и поддерживают его форму; в профазе следующего митоза они вновь появляются в том же виде, что и в предыдущем митозе (первые деления зиготы аскариды).

циклом) в интерфазе наблюдается полярное расположение теломеров (крупных хромоцентров), не успевающих деконденсироваться (ориентация по Раблю). Например, в клетках корневой меристемы лука различимы теломерные (ТМП) и центромерные ЦМП) полюсы (Ченцов, 2004):
- Ориентацию по Раблю сохраняют и политенные хромосомы в клетках слюнных желез дрозофилы (это не делящиеся клетки). Центромеры (ЦМ) собраны в один хромоцентр, теломеры (ТМ) фиксированы на ядерной оболочке, у каждой хромосомы своя территория, они не перемешиваются (Ченцов, 2004).

хроматином и ДНК отдельных хромосом выявляет в интерфазных ядрах, уже далеких от митоза, индивидуальные хромосомные территории (некоторые из них еще сохраняют ориентацию по Раблю). Наличие индивидуальных хромосомных территорий свидетельствует об их целостности и связи с ядерной оболочкой

(Podgornaya et al., 2003)

женского пола млекопитающих (половой хроматин, тельце Барра).
- Закономерное расположение определенных хромосом сохраняется и в метафазной пластинке. Это означает, что в интерфазном ядре они как-то фиксированы и сохраняют целостность, не рассыпаются на фрагменты.
- Работы по доказательству полуконсервативного механизма репликации ДНК. Во 2-м делении в хромосомах одна хроматида мечена, другая нет. Значит, ДНК хроматиды в интерфазе не распадается, сохраняет индивидуальную целостность.
- По данным формальной генетики, в процессах кроссинговера, скрещивания, при хромосомных разрывах функциональной единицей выступает хроматида. Сцепленное наследование признаков (Морган) – тоже следствие неизменного линейного расположения генов в хроматиде.
- У дрозофилы и др. объектов биохимическое определение молекулярной массы ДНК (центрифугирование, электрофорез) дало полное совпадение с расчетной молекулярной массой (исходя из размера митотических хромосом). Т.о., хромосома – одна гигантская молекула ДНК, ее длина не изменяется в клеточном цикле.

блоки гетерохроматина, обычно прицентромерного и теломерного. Удвоение ДНК (хроматид) визуально определяется только по объему и плотности ядра. Генетическая формула клетки: 2n2c → 2n4c.
Профаза. Появляются нитевидные хромосомы (плотный клубок, рыхлый клубок – процесс компактизации). Они сначала длинные и тонкие. Иногда видно, что они уже двойные – это сестринские хроматиды. Начинает разрушаться ядерная оболочка. Генетическая формула клетки: 2n4c.
Прометафаза. Компактизация продолжается. Центромерные участки хромосом под действием нитей веретена выталкиваются к экватору клетки. Ядерная оболочка распалась. Генетическая формула клетки: 2n4c.
Метафаза. Максимальная компактизация хромосом. Все они бихроматидные. Плечи разделены, но центромеры пока еще связаны. Т.к. все центромеры собраны в экваторе (под действие веретена), хромосомы организованы в виде метафазной пластинки. Генетическая формула клетки: 2n4c.
Анафаза. Сохраняется максимальная компактизация. Хроматиды разделяются и под действием веретена расходятся к его полюсам. Генетическая формула клетки: 4n4c.
Телофаза. Формируются дочерние ядра. Начинается деконденсация хромосом, они представляют плотный клубок. Происходит цитокинез. Клетки входят в новую интерфазу. Генетическая формула клетки: 2n2c х 2.

как различны параметры кариотипа: число хромосом, их размеры и форма.

Диплоидные (2n) хромосомные наборы:
1 – 22 хромосомы жабы Bufo arenarum;
2 – 140 хромосом ящерицыTupinambis teguixin;
3 – 12 хромосом чернушки Nigella orientalis (сем. лютиковые);
4 – 208 хромосом камчатского краба
Paralithodes camtschatica;
5 – 46 хромосом человека Homo sapiens;
6 – 23 хромосомы прямокрылого насекомого Chromacris miles;
7 – 8 хромосом сложноцветного растения Hypochoeris tweedie.
NB: Все рисунки выполнены при одном увеличении (Мюнтцинг, 1967).

см ДНК?
Как в ядре диаметром 10 мкм вмещается 1,8 метра ДНК?
Как упакована / распакована ДНК в составе интерфазного хроматина?
Насколько стабильна или лабильна эта упаковка?
Как она влияет на функциональную активность генов?
Чем и как контролируется?
Все дело в белках!
ДНК в составе очищенного хроматина (хромосом) составляет лишь 40 %, остальное – белки, в основном гистоны. Примеси: РНК, углеводы липиды, мембранные фракции.
Химический состав хроматина, относит. ед. (Ченцов, 2004)

лизином и аргинином. Весьма однообразны и консервативны. У эукариот всего 5-7 типов гистонов (Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4, Н5...).
Н3 и Н4 – аргининбогатые гистоны, самые консервативные (у коровы и гороха различия всего по 2 аминокислотам).
Н2А и Н2В – умеренно лизинбогатые. Имеется межвидовая вариабельность.
Н1 – большое семейство лизинбогатых гистонов, самые щелочные (легко отделяются от хроматина в 0,5М солевых растворах). Наименее консервативные, имеются межвидовые и даже межтканевые вариации.
Н5 – содержит много аргинина и серина. Замещает гистон Н1 в эритроцитах низших позвоночных.

(солевые, ионные, электростатические) связи с фосфатными группами ДНК. (В растворах с высокой ионной силой: 1-2М NaCl – все гистоны полностью отделяются от ДНК.) Поэтому хроматиновый ДНП-комплекс имеет лабильную организацию.

Для всех гистонов (особенно Н1) характерно кластерное распределение лизина и аргинина на N- и С-концах молекулы. Именно концы молекулы (щелочные, положительно заряженные) взаимодействуют с ДНК и соседними гистонами. Средние участки нейтральны и образуют 3-4 α-спиральных домена.

(Ченцов, 2004)

и нейтральные белки, очень разнообразные, известно несколько сотен типов. Около 80 % - это белки ядерного (и хромосомного) матрикса.
Функции не только структурные, но и регуляторные. Т.е. фракция негистоновых белков включает разнообразные ферменты, факторы транскрипции и их ингибиторы. Они специфически взаимодействуют с определенными последовательностями нуклеотидов ДНК.

К 1980-м годам в результате морфологических и биохимических исследований сформировалось представление о 4 (5) уровнях компактизации хроматина (хромосом).

мкм).
Хроматин в щелочной среде с низкой ионной силой распадается на тонкие
фибриллы типа «бусы на нитке». «Бусы» – ДНК-гистоновые глобулы
диаметром 10-11 нм, скорость седиментации – 11S. «Нитка» – отрезки ДНК
(толщина 2нм) длиной около 20 нм (разрушается ДНКазой).
Микрококковая нуклеаза режет хроматин на отрезки, кратные 200 нп (200,
400, 600... нп) и 11S (11S, 22S, 33S…). Т.о., выявляются мономеры
(элементарные частицы хроматина), их димеры, тримеры ... Элементарные
частицы получили название нуклеосомы.

(Ченцов, 2004)

нп, сердцевину (кор) из
8 гистонов – октамер (2хН2А, 2хН2В, 2хН3, 2хН4) и
одну молекулу гистона Н1. Вокруг кора 146 нп
образуют 1,75 оборота, остальные 54+ нп (8-114)
образуют свободный линкер.
Гистоны Н1 расположены поверх нуклеосом,
взаимодействуя с кором и линкером.
Минимальная нуклеосома – то же без линкера и Н1.
Коэффициент компактизации ДНК в нуклеосомной фибрилле = 6-7х.
NB: гистон Н1 для образования самих нуклеосом не требуется, но участвует в стягивании соседних нуклеосом при формировании следующего уровня компактизации.
Нуклеосомная структура хроматина устанавливается сразу в момент репликации ДНК, так как синтез гистонов немного опережает синтез ДНК. Старые и новые октамеры гистонов (коровые частицы) распределяются между сестринскими цепями ДНК случайным образом. В репликативной вилке, а также под РНК-полимеразой при синтезе РНК нуклеосомы, вероятно, расщепляются в полунуклеосомы, не сползая с ДНК.

(Альбертс и др., 1994)

действием гистона Н1. При его удалении фибрилла разворачивается в нуклеосомную (10нм) нить.
Существуют 2 модели упаковки 30 нм фибриллы: соленоидная и нуклеомерная (см. рис.).
Нуклеомеры – сверхбусины, «супербиды». При обработке нуклеазой они могут разделяться и образовывать 30 нм глобулы с константой седиментации 45S. В ЭДТА и при удалении магния 30 нм глобулы разворачиваются в нуклеосомные цепочки (по 6-8 нуклеосом).
Гистоны Н1 также организованы в кооперативные группы по 6-8 молекул.
Коэффициент компактизации ДНК в 30 нм фибрилле = 40-42х.
NB: Второй уровень упаковки не траскрибируется! Взаимодействие с ферментами и многими регуляторными белками невозможно. Гены блокированы.

(Ченцов, 2004)

белки (матриксины) связываются с особыми участками ДНК и стягивают их в петли. Это особая ДНК – MAR-участки (matrix attachment region) – интерфазные, или SAR-участки (scaffold attachment region) – митотические.
Т.о. дискретная единица 3-го уровня компактизации – петельный домен.
(NB: один петельный домен соответствует репликону III порядка и содержит 1 или несколько генов. В основаниях петель находятся регуляторные белки.)
Несколько петельных доменов (15-80) объединены матриксинами в розетку, а свернутая розетка формирует хромомер (диаметр 100-150 нм).

Хромомеры в составе хромосом, частично деконденсированных при гипотонии. а –общий вид; б – крупно. (Ченцов, 2004)

50 мкм ДНК.
При обработке протеиназами белки расщепляются и хромомеры-розетки рассыпаются с освобождением 30 нм фибрилл, а при обработке ДНКазами исчезают петельные домены.
Хромомерная упаковка дает коэффициент компактизации 600-700х.
- Вся совокупность хромомеров одной развернутой хромосомы в интерфазном ядре представляет общий тяж – хромонему (толщина 0,1-0,2 мкм). Хромонемы с упакованными хромомерами видны в ранней профазе митоза или даже в метафазных хромосомах при их искусственной деконденсации.

Хромомеры, выделенные из макронуклеуса инфузории (Попенко: Ченцов, 2004)

Хромонема с хромомерами, находящимися в различном состоянии (Ченцов, 2004)

(толщина 1-1.5 мкм), так что видны и та и другая.

Хромосомы в профазе митоза. В них видны свернутые хромонемы. (Ченцов, 2004)

раннем G1-периоде происходят обратные процессы – раскручивание хроматид в хромонемы, развертывание хромомеров в розетки, петли 30 нм фибрилл локально разворачиваются в 10 нм нити. Становится возможной транскрипция генов и репликация.

Метафазные хромосомы на срезе в трансмиссионном ЭМ (а, б)
и с поверхности в сканирующем ЭМ (в). (Ченцов, 2004)

Ченцов, 2004, 2010 Анисимов, 2008, 2017

совокупность микротрубочек и моторных белков-транслокаторов. Цикл веретена в целом согласован с циклом хромосом, что обеспечивает синхронность процессов.
 6.1. Микротрубочки (25 нм) – элементы цитоскелета, состоят из белков тубулинов и микротрубочко-ассоциированных протеинов (MAPs).
Локализация МТ различна : бывают одиночные МТ, рыхлые пучки, центриоли и базальные тельца (3х9), аксонема ресничек и жгутиков (2х9 + 2). Во время митоза большая часть МТ входит в состав митотического веретена.
Полимеризация МТ.
Субъединицы α- и β-тубулина (5 нм) образуют гетеродимеры,
потом кольца (нуклеация), потом трубочки в 13 продольных протофиламентов. Полимеризация сопровождается
гидролизом ГТФ до ГДФ.
Димеры изначально поляризованы, поэтому и каждая МТ
оказывается полярной. Быстро растущий плюс-конец и
медленно растущий или разбираемый минус-конец (разная
скорость гидролиза ГТФ, до его полной остановки).

(по:Campbell, 1996)

удлинение МТ. Но при недостатке тубулинов и ГТФ МТ могут разбираться с двух концов = полная разборка. Разборка усиливается при понижении температуры и в присутствии Са2+.
Колхицин (алкалоид) связывается с тубулином и препятствует полимеризации МТ = разборка цитоплазматических МТ (потеря формы клеток) и МТ митотического веретена. То же с колцемидом и нокодозолом, но после отмывки МТ восстанавливаются.
Таксол, напротив, способствует полимеризации тубулина, даже при низких концентрациях = избыточный рост МТ.
MAP-белки ускоряют полимеризацию = стабилизируют МТ в дифференцированных клетках.
ВЫВОД: МТ являются очень динамичными структурами, способны быстро возникать и разрушаться. Время полужизни МТ = около 5 мин! За 15 мин. обновляется около 80% МТ.
В дифференцированных клетках до 20 % МТ стабилизированы, «живут» несколько часов (дополнительные MAPs, ацетилирование по лизину, удаление терминального тирозина).

формы клетки,
поддержание отростков
(нейроны, фибробласты,
эритроциты, радиолярии
и т.п.).
Клетка без МТ – шар.

- Растяжение клеток, быстрый рост в длину, совместно с клеточной стенкой (типично для растений).

NB: Двигательная функция ! – внутриклеточный направленный транспорт органелл и включений, экзоцитоз (мерокриновая секреция), движение ресничек и жгутиков, работа митотического веретена.

(по: Ченцов, 2004)

открыт быстрый транспорт веществ – намного более быстрый, чем общий ток цитоплазмы. Скорость = 20-40 см/сут.
Это оказалось перемещение вакуолей (везикул) и гранул по микротрубочкам.
Т.о., микротрубочки – не просто направляющие пути для перемещения органелл. Это «рельсы», по которым движутся «локомотивы», без них это движение невозможно.
NB: Транспорт по микротрубочкам идет в двух противоположных направлениях.

(Ченцов, 2004)

к «+»-концам микротрубочек.
Моторный белок – кинезин с АТФазной активностью.
Связующий белок – кинектин – специфичен для разных «грузов»: митохондрий, везикул Гольджи, лизосом, синаптических пузырьков, антипараллельных МТ в митотическом веретене.
Ретроградный транспорт – назад, от нервных окончаний к телу нейрона, т.е. к «-»-концам микротрубочек.
Моторный белок – динеин, тоже АТФазно-активный.

Различают цитозольный динеин – работает в цитоплазме на транспорт везикул и расхождение хромосом в митозе,
а также аксонемный динеин – в киноцилиях (ресничках и жгутиках).

(по: Ченцов, 2004)

на периферию и к центру.
Это же самое мы увидим в работе митотического веретена.











(NB: имеется принципиальное сходство тубулин-кинезиновой и тубулин-динеиновой двигательных систем с актин-миозиновой мышечной системой: скелетные элементы + двигательные АТФазные белки. Возможна их гомология.)

(по: Ченцов, 2004)

идут из центров организации микротрубочек – ЦОМТов.
На ЦОМТах фиксированы минус-концы, блокированные с помощью МАРs,
к периферии обращены плюс-концы.

Происходит постоянная закладка новых МТ у ЦОМТов и их рост к периферии. (Доказано в опытах с разрушением МТ колцемидом или холодом с последующим их восстановлением из центра (Ченцов и сотр.)

NB: Отрастающие МТ могут терять связь с ЦОМТами, после чего перемещаются (тредмиллинг), стабилизируются или разбираются.

(по: Ченцов, 2004)

клетках имеется клеточный центр (как органоид, а не геометрический центр клетки), состоящий из плотного тельца центросомы, светлого поля – центросферы и астральной лучистости – астросферы.

центросфера – зона расположения центриолярных сателлитов, глобул (ФСМТ) и матрикса, астросфера – микротрубочки.
Именно сателлиты и прилежащие глобулы (ФСМТ), а не центриоли являются истинными ЦОМТами.

По: Ченцов, 2004)

(Ченцов, 2004)

по консервативному принципу: отрастанием сбоку. Механизм не известен. Центриоли имеют разный возраст.
Сателлиты и ФСМТ имеются только на материнской центриоли.

NB: У высших растений, низших грибов, некоторых простейших ЦОМТы не имеют четкой локализации, так как в них нет центриолей. Диффузный ЦОМТ-материал локализован на периферии клеточного ядра (снаружи или внутри), откуда МТ расходятся радиально.
Это подтверждает, что истинные ЦОМТы – не центриоли, а прилежащий материал.
Сами центриоли – лишь «пассажиры», расходящиеся с гарантией в дочерние клетки во время митоза (аналогия Ю.С. Ченцова).

А функция центриолей – это потенциальные базальные тельца киноцилий (ресничек и жгутиков).

а ЦОМТы организуют митотическое веретено и расхождение хроматид в митозе.
Т.о., существует центросомный цикл.
В центросомном цикле происходит 2 процесса:

- расхождение и удвоение центриолей,
- перестройка ЦОМТов и микротрубочек.

В G1-периоде (после митоза) – 1 диплосома. Веретено разрушено. Материнская центриоль имеет сателлиты. Начинается рост микротрубочек, их отрыв и движение на периферию.

(по: Ченцов, 2004)

У материнской и дочерней центриолей сбоку отрастают процентриоли (дочерняя и внучатая). Механизм неизвестен.
У тетрахимены находили цДНК, но интерпретации нет.

В G2-периоде клетка имеет 2 клеточных центра – 2 полюса митотического веретена. Сателлиты каждой материнской центриоли перестраиваются в рыхлую волокнистую муфту – фибриллярное гало, от которого начинают отрастать МТ веретена. При этом старые цитоплазматические МТ разрушаются (клетка округляется), а пул тубулинов используется на построение новых МТ веретена.

От гало центриолей обоих полюсов исходит поток обновляемых МТ (показано в опытах).

В телофазе веретено разбирается. Гало исчезает. Восстанавливаются сателлиты.

NB: Такая динамика характерна для тканевых и культуральных клеточных линий с умеренной скоростью пролиферации.
В эмбриональных клеточных циклах, с коротким циклом, удвоение центриолей происходит много раньше – еще в предыдущем цикле.

и приобретает окончательные формы в метафазе.
При этом часть растущих МТ своими «+»- концами захватываются кинетохорами хромосом, содержащими специальный белок CENT-A, а также динеин.

Прометафазные хромосомы, окрашенные DAPI на ДНК и антителами к CENT-A (Ченцов, 2004: фото И.С. Кудрявцева).

Профаза

Формирование кинетохора в течение профазы – метафазы. Показана только 1 хроматида.

Ченцов, 2004)

МТ выталкивают хромосомы (точнее – их центромеры) в экватор клетки.
Митотическое веретено фактически состоит из двух полуверетен – двух клеточных центров.
Различаются 3 группы МТ:
- хромосомные (кинетохорные) МТ – связывают центриоли с кинетохорами хромосом; формируют хромосомное веретено;
- центральные (межполюсные) МТ – не касаются хромосом; перекрываются и формируют центральное веретено;
- полюсные (астральная лучистость) – МТ, направленные на периферию клетки.

Метафаза

их расхождение к полюсам веретена.
Работают 2 механизма с участием микротрубочек и моторных белков.
В анафазе-А динеин кинетохоров протаскивает хроматиды по МТ хромосомного веретена в минус-направлениях (к полюсам);
по следу МТ разрушаются.
В анафазе-Б кинезин в составе парных мостиков движется по МТ центрального веретена в плюс-направлениях и раздвигает полюса.
Оба события происходят одновременно. В итоге сестринские хроматиды (хромосомы)
симметрично расходятся, а полюса раздвигаются и клетка удлиняется.

Анафаза

осуществляется цитокинез (цитотомия) – деление самой клетки.

- Разошедшиеся хроматиды собираются у полюсов и формируют новые ядра (2n2c);
- хроматиды деконденсируются и превращаются в хроматин, работа генов (транскрипция) возобновляется;
- в том числе восстанавливаются ядрышки – начинается производства рРНК и сборка рибосом;
- восстанавливаются ядерные оболочки путем сборки везикул ЭПР.
Микротрубочки веретена, кроме астральных, разрушаются. Каждая клетка получает один клеточный центр – пару центриолей в окружении МТ.
Параллельно идет цитокинез.

Телофаза

эктоплазме клетки – реализуется в животных клетках.
Активность аппарата Гольджи, вынос мембранных везикул в плазмалемму – работает в растительных клетках, образуется фрагмопласт (влияет присутствие клеточной стенки).
BN: цитокинетический цикл – самостоятельный, со своими механизмами и своей регуляцией.

7. Цитокинез (цитотомия)

(по: Ченцов, 2004)

ПРИЛОЖЕНИЕ
Митотический цикл в клеточной культуре
(Ченцов, 2004; фото А.В. Буракова и А.Л. Ходякова)

S-G2; расхождение дочерней и материнской центриолей.

Микротрубочки окрашены антителами к тубулину. Центриоли желтые.

Метафаза Анафаза
Микротрубочки веретена и клеточные центры – желтые; хромосомы –голубые; промежуточные филаменты цитоскелета – красные.

Поздняя телофаза.
Окраски те же, что на предыдущих фотографиях.

центросомный цикл;
- цитокинетический цикл.
Каждый цикл имеет свою регуляцию. В норме эти циклы согласованы, но возможны рассогласования, приводящие к нарушениям митоза с различными последствиями.