Репликация ДНК. (Лекция 6) презентация

Репликация ДНК

клетке

ДНК происходит не беспорядочно,
а в строго определенный период жизни клетки.
Синтез ДНК происходит в S-фазу клеточного цикла, когда клетка готовится к делению.

полуконсервативный; б) консервативный; в) дисперсивный

ДНК

Сталь
Доказательство полуконсервативного механизма репликации ДНК
Артур Корнберг – Открытие ДНК-полимеразы

.
Прерывистость.
Потребность в затравке.

формирующийся в репликативной вилке для осуществления синтеза ДНК.

Cодержит примерно 15 - 20 белков и включает:
• Топоизомеразу
• Хеликазу
• ssb-белки (single strand binding proteins)
•Праймазу
• множество дополнительных белков
• ДНК – полимеразы

Репликация ДНК

Репликация ДНК осуществляется реплисомой

- узнавание области начала репликации,
привлечение к месту сборки остальныхт белковых
компонентов;
• Dna B - ДНК-хеликаза – разделение цепей ДНК в репликативной вилке;
• Dna C - обеспечение взаимодействия хеликазы и праймазы с ДНК;
• Dna G - праймаза – синтез РНК-затравок;
• ssb - белки, взаимодействие кооперативно с одноцепочечной ДНК и стабилизирующие расплетенный комплекса;
• ДНК-лигаза – лигирование (сшивание) фрагментов Оказаки;
• Топоизомераза I – создание шарнина для раскручивания цепей ДНК в репликативной вилке;
• Топоизомераза II – (ДНК-гираза) - разделение катенанов.

II, Pol III, Pol IV и Pol V.

■ В репликации ДНК принимают участие Pol I и Pol III.

■ ДНК-П I участвует в удалении праймера, застройке образовавшейся бреши, коррекции ошибок.
■ ДНК –П III - основной фермент репликации ДНК, синтезирует лидирующую и отстающую цепь ДНК, обладает корректорской функцией.

■ ДНК-П II, IV и V осуществляют репаративный синтез ДНК.

Репликация ДНК

ДНК –полимеразы прокариот

«скользящего
зажима»
τ - белок - сборка и димеризация холофермента
ДНК-полимеразы
γ-комплекс (γ,δ,δ´,χ,ψ) – cвязывание с
матрицей, активация
ДНК-полимеразы

элонгацию молекулы ДНК, добавляя
нуклеотиды к 3΄-концу предшествующего нуклеотида. От дезоксинуклеозидтрифосфата отделяется РРi, который далее
расщепляется до двух молекул фосфорной кислоты.

- ТТР, dАТP, dGТP, dCТP;
ионы Mg2+;
источники энергии - ТТР, dАТP, dGТP, dCТP; затравка (праймер) со свободной 3ʹ-ОН-группой.

Каждая цепь ДНК служит
матрицей для синтеза
комплементарной
дочерней цепи.
Синтез ведущей (лидирующей) дочерней цепи ДНК идет непрерывно в
направлении 5´→3´,
совпадающим с движением репликативной вилки.
Отстающая дочерняя цепь ДНК – синтез
прерывистый, в виде
фрагментов Оказаки.

вилки

Элонгация – синтез новых цепей

Терминация – завершение синтеза двух дочерних цепей ДНК

начинается в уникальном сайте хромосомы, точке репликации – ori C, из которой репликация осуществляется двунаправлено до точки окончания (terminus).
Оri C – инициирующая последовательность Е.coli длиной 245 пар характеризуется высоким содержанием АТ-пар, которые легко денатурируют. К этому участку присоединяются 10-20 молекул инициаторного белка dnaA и АТР.
Это приводит к плавлению молекулы ДНК и раскрытию цепей. Далее происходит присоединение белков dnaС,
dnaВ (хеликазы), ssb-белков и dnaG (праймазы).
Формируется репликативная вилка.

5′ → 3 ′ растущей цепи.
Очередной нуклеотид присоединяется к свободному 3 ′-ОН-концу предшествующего нуклеотидного остатка.

Синтезируемая цепь всегда антипараллельна матричной цепи.

полинуклеотидных цепей ДНК. Каждая репликативная вилка включает, по крайней мере, две молекулы ДНК-полимеразы III (димер) , ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомераза, которая раскручивает плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликаза, которая расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи.
Ведущая цепь ДНК реплицируется непрерывно в направлении 5ʹ→3ʹ, совпадающим с движением репликативной вилки. Отстающая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Преодоление антипараллельности цепей ДНК при репликации достигается путем образования петельной структуры. Отстающая цепь ДНК временно образует петли вокруг реплисомы так, что димер ДНК-полимеразы получает возможность перемещаться одновременно по обеим цепям в одном 5ʹ→3ʹ направлении на короткое расстояние.

через небольшой промежуток времени, синтезировав короткий отрезок ДНК, покидает матричную отстающую цепь. Эти короткие (до 1000 пар нуклеотидов) отрезки ДНК, образующиеся на отстающей цепи, получили название фрагментов Оказаки – по имени Р. Оказаки, впервые (1968 год) указавшего на прерывистый характер синтеза ДНК. Новое присоединение мономера ДНК-полимеразы к матрице происходит после предварительного синтеза нового праймера. Каждый фрагмент Оказаки начинается с короткой РНК-затравки (10 – 12 пар нуклеотидов), необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев. Кроме полимеризации цепей, которую осуществляет Рol III, в ходе элонгации ДНК происходят следующие события:
1) вырезание РНК-праймеров из фрагментов Оказаки. Эту функцию выполняет Pol I, благодаря 5´→3´-экзонуклеазной активности;

удаления праймеров. В этом процессе участвует также ДНК-полимераза I, используя для встраивания нуклеотидов 3´-ОН-группу соседнего фрагмента Оказаки;
3) Соединение фрагментов Оказаки в отстающей цепи с помощью фермента ДНК-лигазы;
4) Исправление ошибок репликации, благодаря 3´→5´-экзонуклеазной активности, которой обладают как Pol III, так и Pol I.

III. Терминация репликации.

Терминация синтеза ДНК наступает вследствие исчерпания матрицы. Репликационные «глазки» сливаются, и на каждой матричной цепи образуется дочерняя цепь ДНК.

эукариот много длиннее, а сами хромосомы устроены намного сложнее, чем маленькие и простые бактериальные геномы. У высших клеток, в отличие от бактерий, ДНК в хромосомах образует комплекс с белками (гистонами), которые участвуют в сворачивании длинных нитей ДНК в серию петель, для того чтобы их можно было упаковать внутри ядра.

начинается одновременно в нескольких сайтах гигантской молекулы ДНК каждой хромосомы. Число их у эукариот может превысить 1000, поэтому большой набор ДНК-последовательностей реплицируется за 5—20 часов.
Из каждой такой точки в противоположных направлениях одновременно движутся две репликативные вилки. Репликация продолжается до полного завершения синтеза дочерних цепей и разделения новых дуплексов.

(20 нуклеотидов), а затем заменяется полимеразой δ и ε. Полимераза δ является основной ДНК-полимеразой у эукариот. Роль ДНК-полимеразы ε менее ясна, однако последние данные свидетельствуют о том, что она участвует в репликации отстающей цепи ДНК.
ДНК-полимераза β удаляет праймеры и застраивает бреши, образовавшиеся на месте вырезанного праймера.
Фрагменты Оказаки у эукариот имеют длину порядка 150-200 нуклеотидов. Они сшиваются ДНК-лигазой.
ДНК-полимераза γ реплицирует митохондриальную ДНК.
 

у про- и эукариот

организмов восстанавливать нарушения
и повреждения, возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а также при воздействии разнообразных эндогенных и внешних мутагенных
факторов. Осуществляется специальными ферментными системами клетки.
Повреждающие факторы:
Радиация
Ультрафиолетовое излучение
Химические вещества
Ошибки репликации
Апуринизация – отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова
Дезаминирование – отщепление NH2-группы от азотистого основания

за одну 20-ти часовую генерацию
спонтанно возникает около 10000
апуриновых сайтов и около 500 – апиримидиновых.