- Главная
- Разное
- Дизайн
- Бизнес и предпринимательство
- Аналитика
- Образование
- Развлечения
- Красота и здоровье
- Финансы
- Государство
- Путешествия
- Спорт
- Недвижимость
- Армия
- Графика
- Культурология
- Еда и кулинария
- Лингвистика
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Маркетинг
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Рекомбинантные антитела для диагностики и терапии презентация
Содержание
- 1. Рекомбинантные антитела для диагностики и терапии
- 5. АНТИГЕН – ЛЮБАЯ СУБСТАНЦИЯ, КОТОРАЯ СПОСОБНА СВЯЗЫВАТЬСЯ
- 6. АНТИГЕННАЯ ДЕТЕРМИНАНТА (ЭПИТОП) – ФРАГМЕНТ СТРУКТУРЫ АНТИГЕНА,
- 10. АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ЦЕНТР
- 15. Эффекторные функции антител
- 16. Активация иммунного ответа через антиидиотипические антитела
- 17. Биологическая активность антител
- 21. Трехмерные модели Fab и Fc
- 24. 7 nm×880 Строение бактериофага М13
- 25. Amplify V-genes by PCR
- 26. Construction of miniantibody library.
- 27. Construction of miniantibody library. PCR
- 28. Electrophoresis of DNA fragments obtained after PCR. VH VL VH-linker-VL Linker=(Gly4Ser)3 b.p. b.p.
- 29. Cloning scFv DNA into a Phagemid Vector.
- 32. Selection Strategies for Obtaining Specific Phage Ligand.
- 34. Чашка Петри с колониями E.coli .
- 35. Colony lift screen Analysis
- 36. Recloning in expression vector
- 38. Insertion of c-myc and LNKB-2 epitop tags
- 39. Selection of scFv clones for sandwich ELISA to analyze Granulocyte Colony Stimulation Factor.
- 40. G-CSF titration with sandwich ELISA (F20-F16 scFv).
- 41. Оптимизация условий очистки и ренатурации scFv Инкубация
- 42. Рис. 4. Электрофоретический анализ белковых препаратов на
- 43. Оценка чистоты препарата после ренатурации и концентрирования scFv
- 44. Определение констант аффинности миниантител Рис.6. Определение
- 45. Изменение аффинности рекомбинантных антител
- 47. Стратегия улучшения антигенсвязывающих параметров антител
- 53. Влияние фукозилирования антител на антитело зависимую цитотоксичность
- 54. Гликозилирование белков в диком и рекомбинантном штаммах Pichia Pastories
- 55. Гликозилирование рекомбинантных белков
- 56. Schematic presentation of whole IgG and different fragments
- 62. Anti –erbB2 scFv Affinity from 10-7 to
- 65. Антитела активаторы клеток иммунной системы как инструменты в онкоиммунологии
- 66. Молекулярные мишени для активаторных – супрессорных антител
- 67. Стратегия использования антител – иммуностимуляторов
- 68. Молекулярные механизмы резистентности к терапии антителами
- 72. Антитела могут помогать патогенам
- 78. Antibody Humanization
- 79. Antibody Humanization
Слайд 5АНТИГЕН – ЛЮБАЯ СУБСТАНЦИЯ, КОТОРАЯ СПОСОБНА СВЯЗЫВАТЬСЯ С АНТИТЕЛАМИ.
АНТИТЕЛО - БЕЛОК
Слайд 6АНТИГЕННАЯ ДЕТЕРМИНАНТА (ЭПИТОП) – ФРАГМЕНТ СТРУКТУРЫ АНТИГЕНА, С КОТОРЫМ СВЯЗЫВАЕТСЯ АНТИТЕЛО.
ГАПТЕН
Слайд 9
ОБЩАЯ СХЕМА СТРОЕНИЯ lgG1
ВАРИАБЕЛЬНАЯ ОБЛАСТЬ
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ ( 450 ОСТАТКОВ )
ШАРНИРНАЯ
ОБЛАСТЬ
ЛЕГКАЯ
VL
CL
VH
CH1
CH2
CH3
Слайд 10
АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ЦЕНТР
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
( 450 ОСТАТКОВ )
ШАРНИРНАЯ
ОБЛАСТЬ
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
( 212
CH2
CH3
VL
VH
CH1
CL
СТРУКТУРА lgG1
Слайд 25
Amplify V-genes by PCR
Clone for display as scFv or Fab
fragments in
Rescue phagemid library
with helper phage
Affinity select on antigen
Elute bound phagemids
Infect TG1 cells (sup)
for phage display
Infect HB2152 (non-sup)
for soluble expression
Rescue individual
clones with helper phage
ELISA with
phage antibodies
Induce expression of
individual clones
ELISA with
soluble fragments
repeat
3-5 times
Immunized
repertoire
Unimmunized
repertoire
Synthetic
repertoire
Слайд 27Construction of miniantibody library.
PCR amplification of DNA corresponding
VH and
Gene assemble and stepwise cloning
VH
Vκ
Vλ
DNA markers
scFv(κ)
scFv(λ)
Слайд 28Electrophoresis of DNA fragments
obtained after PCR.
VH VL
VH-linker-VL
Linker=(Gly4Ser)3
b.p.
b.p.
Слайд 34Чашка Петри с колониями E.coli .
Перенос колоний E.coli на нитроцеллюлозный
Инкубация фильтров с сорбированными колониями на питательной среде с IPTG(1 мМ) в течение 2-3 часов при 30 0С
Лизис колоний E.coli в парах хлороформа
Совмещение фильтра с лизированными колониями Е.coli с фильтром с сорбированным ботулиническим антигеном А (100 нг/мл)
Скрининг клонов-продуцентов scFv E.coli к белковым антигенам
Слайд 35Colony lift screen
Analysis
~ 103 clones
Analysis
~ 102 clones
Preparative protein expression, purification
and analysis (sequence, Kd, specifity )
trxA-scFv expressed E.coli
Слайд 36Recloning
in expression vector
Restriction of total ScFv gene from pHEN2
Selection
Слайд 38Insertion of c-myc and LNKB-2 epitop tags
Sfi I
Sfi I
Not I
Not I
Not
amber
amber
myc
myc
IL-2 - tag
pHEN1
pHEN1
Слайд 39Selection of scFv clones for sandwich ELISA to analyze Granulocyte Colony
Слайд 41Оптимизация условий очистки и ренатурации scFv
Инкубация культуры E.coli Origami
pRAREв условиях
интенсивной аэрации при 30 0С
Экстракция внутреклеточного белка
в денатурирующих условиях
(8 М мочевина,рН8)
Очистка белка металл-хелатной хроматографией на Ni-NTA агарозе
в денатурирующих условиях
Снятие целевого белка:
- понижением рН реакционной среды
- имидазолом
- EDTA
Рефолдинг scFv при понижении
концентрации денатурирующего агента
с использованием рефолдинг-буфера
Рефолдинг на колонке
Слайд 42Рис. 4. Электрофоретический анализ белковых препаратов на разных стадиях очистки в
1- Тотальный клеточный экстракт E.coli (10 мкг) до очиски на Ni-NTA агарозе
2 - Очищенные, сконцентрированные scFv 21(15мкг)
3 - Очищенные, сконцентрированные scFv 31(15 мкг)
4 -Очищенные,
сконцентрированные scFv 5 (15мкг)
M - белковый маркер “Хеликон”
Оценка чистоты препарата после ренатурации и концентрирования scFv
Слайд 44Определение констант аффинности миниантител
Рис.6. Определение константы аффинности
миниантител клона С31. с
Кd =1,4*10 -8 М
Слайд 62Anti –erbB2 scFv
Affinity from 10-7 to 10-9
Activity in cellular test
Binding activity from 2 to 400 nM
Diabody and tumor targeting better for 2 nM
Anti mesothelin SS antibody (scFv) 0,8 nM 10 fold active that 11 nM,
But another mutant with 0,2 nM affinity have low activity that 0,8 nM
Binding Site Barrier
Hypothesis
