Половые различия функций фагоцитирующих клеток у крыс презентация

к.м.н., доцент Шилов Юрий Иванович
Научный консультант
к.м.н., доцент кафедры
нормальной физиологии
ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера

Половые различия функций фагоцитирующих клеток у крыс

: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

красителей родоминах*, разработан Life Technologies (Invitrogen).
Флуоресценция pHrodo™ резко возрастает в кислой среде. В нейтральной среде (pH 7,0-7,4) флуресценции нет.
Существует множество коньюгатов с pHrodo для оценки фагоцитоза (Escheriachia coli, Staphilococcus aureus, Zymosan A-Sacchromyces cervisisae).

* Информация о химической структуре взята из статьи, стр.2722 :
Han, Junyan, and Kevin Burgess. "Fluorescent indicators for intracellular pH."Chemical reviews 110.5 (2009): 2709-2728.
http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/cr900249z

http://www.b2b.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/Key-Molecular-Probes-Products/On-a-Cellular-Level.html

532 nm

575 600 625 650 675 700
Wavelength (nm)

500 520 540 560 580 600 620 640 660
Wavelength (nm)

Fluorescence Emission

Ex 488 nm

pH 4

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8

По данным сайта компании производителя www.lifetechnologies.com

Зависимость интенсивности флуоресценции
pHrodo™ RED и pHrodo™ GREEN от pH среды

в возрасте 4-7 месяцев, разделенных на 3 экспериментальные группы: самцы, самки в проэструсе и самки в диэструсе.

источник взят с сайта : https://www.google.com/pictures151515151515.jpg

Кабаком (1968). Оценивали регулярность изменения фаз в течение не менее двух циклов и отбирали животных для эксперимента в фазы диэструса и проэструса.

(Sigma-Aldrich, США).

Перитонеальные лейкоциты выделяли промыванием брюшной полости 10 мл среды 199 с 10 ЕД/мл гепарина.

источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

10 мин.
После снятия супернатанта концентрацию клеток доводили до 25*106 кл/мл добавлением ППС (среда RPMI-1640 без L-глютамина с добавлением 2 мМ GlutaMax™, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот в МЕМ (Gibco®, life technologies™), 10 мМ HEPES (Sigma-Aldrich).

Источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

меченого зелёным pHrodo™ (100*106 частиц/мл; pHrodo™ Green zymosan A BioParticles® conjugate, Molecular probes® by life technologies™, P35365, Lot 1617699)
+ 4 мкл аутоплазмы
Преинкубация 30 мин при 37ºС

+

Инкубация 2 часа

Пробы перемешивали на Vortex-Genie-2
(Scientific Industries, США)
и инкубировали 120 мин при 37ºС.

* - среда RPMI-1640 без L-глютамина с добавлением 2 мМ GlutaMax™, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот в МЕМ (Gibco®, life technologies™), 10 мМ HEPES (Sigma-Aldrich.

M ЭДТА, pH=7,2-7,4)

Лизирование

Источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

0,5 М ЭДТА + 92,95 объёма забуференного 10 мМ HEPES изотонического раствора NaCl) и доводили до объема 250 мкл стоп-реагентом и вносили в 96-луночный плоскодонный планшет для ИФА («Медполимер», Санкт-Петербург).

Остановка фагоцитоза

Источник: Шилов С. Ю.

проводили методами описательной статистики и непарного t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Источник: Шилов С. Ю. Рабочие листы программы Guava Cytosoft 5.3, модули Guava Express Plus/Pro

колебаниями уровней гормонов в зависимости от фазы эстрального цикла (10 самок выборки на момент исследования находились в фазе проэструса, 10 – в фазе диэструса).

крови и перитонеальных клеток крыс с использованием зимозана, меченного флуорохромом – зелёным pHrodo™, отражающим уровень ацидификации фагосом, установлено, что у самок крыс в сравнении с самцами наблюдается более интенсивное свечение поглощённых объектов и его более выраженная вариабельность .

Источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

крыс с использованием зимозана, меченного отражающим уровень ацидификации фагосом флуорохромом – зелёным pHrodo™.
Установлено, что у самок крыс в сравнении с самцами наблюдается более интенсивная флуоресценция поглощённых объектов.
Помимо этого, показатели фагоцитоза у самок характеризуются значительно большей вариабельностью, нежели у самцов.

МАРКЕРА АЦИДИФИКАЦИИ ФАГОСОМ pHrodoTM

Шилов Станислав Юрьевич1, 2, Жукова Анастасия Евгеньевна2,
Петухова Анастасия Андреевна3,
Барков Сергей Юрьевич2,
Шилов Юрий Иванович1,2,3

1ФГБУН Институт экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь


2ГБОУ ВПО «Пермский государственный
медицинский университет имени академика
Е.А. Вагнера» Минздрава России, г. Пермь,

3ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Источник: Петухова А. А. Обложка Российского иммунологического журнала

в буфере pH=4

pHrodo™ RED (Ex/Em=560/585 nm) в буфере pH=4

По данным сайта компании производителя www.lifetechnologies.com

другими инструментальными методами является сложность отделения нефагоцитированных меченых объектов фагоцитоза от поглощенных, которая усугубляется их агглютинацией при взаимодействии с антителами биологических жидкостей.

Фагоцитоз

http://www.b2b.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/Key-Molecular-Probes-Products/On-a-Cellular-Level.html

при использовании традиционных флуорохромов, например флуоресцеинизотиоционата (ФИТЦ), в ходе цитофлурометрического исследования иногда сложно отделить при гейтировании поглощенные объекты от адгезированных к фагоцитам.

Традиционные флуорохромы

http://www.b2b.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/Key-Molecular-Probes-Products/On-a-Cellular-Level.html