Слайд 1Министерство здравоохранения Республики Беларусь учреждение образования
Мозырский государственный медицинский колледж
Индивидуальное задание по практике
По дисциплине: Биохимия с биохимическими исследованиями
По теме: Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови кинетическим методом
Подготовила учащаяся : МДд-22
Сопот Карина Юрьевна
Специальность: Медико-диагностическое дело
Приняла: Дунайская Н.Е.
Мозырь,2017
Слайд 2Аминотрансферазы (трансаминазы) — ферменты, катализирующие межмолекулярный перенос аминогруппы от соответствующих аминокислот
на a‑кетокислоты (2‑оксокислоты) с образованием новых кето- и аминокислот без образования свободного аммиака, в качестве кофермента используется витамин В6 (пиридоксин). Эти ферменты играют центральную роль в обмене белков, осуществляя окислительное дезаминирование аминокислот опосредованно через глутаминовую кислоту. Образующаяся глутаминовая кислота дезаминируется глутаматдегидрогеназой с освобождением свободного аммиака и 2‑оксоглутаровой кислоты.
Слайд 3В организме человека наибольшее значение имеют две аминотрансферазы: аспартатаминотрансфераза (АСТ или
АсАТ) (L‑аспартат:2‑оксоглутарат-аминотрансфераза, КФ 2.6.1.1.) и аланинаминотрансфераза (АЛТ или АлАТ), (L‑аланин:2‑оксоглутарат-аминотрансфераза, КФ 2.6.1.2.). В клинической практике чаще всего определяют именно активность этих двух ферментов. Существует также другое название указанных ферментов: для АСТ — глутаматоксалоацетатаминотрансфераза (ГОАТ), для АЛТ — глутаматпируватаминотрансфераза (ГПАТ). Ниже приведены реакции, катализируемые этими ферментами:
2-Оксоглутарат + Аспартат ↔ Глутамат + Оксалоацетат
2-Оксоглутарат + Аланин ↔ Глутамат + Пируват
Слайд 4В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга (см выше).
Эти методы являются наиболее специфичными и точными для исследования активности трансаминаз сыворотки крови, основаны на различии поглощения окисленной и восстановленной форм НАД при 340 нм и требуют постановки индикаторных реакций, в которые вовлекаются продукты основной реакции:
Слайд 5Существующие методы определения активности трансаминаз в сыворотке крови можно разделить на
две основные группы: колориметрические и спектрофотометрические:
Слайд 6В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга. Эти методы
являются наиболее специфичными и точными для исследования активности трансаминаз сыворотки крови, основаны на различии поглощения окисленной и восстановленной форм НАД при 340 нм и требуют постановки индикаторных реакций, в которые вовлекаются продукты основной реакции:
Оксалоацетат + НАДH ↔ Малат + НАД
Пируват + НАДH ↔ Лактат + НАД
Слайд 7Группа колориметрических методов:
основанные на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты. Наибольшее применение
нашел метод Райтмана‑Френкеля, являющийся технически простым и дающим воспроизводимые результаты.
азометоды, основанные на образовании цветного
соединения между щавелевоуксусной кислотой и 6‑бензамидо-4‑метокситолуидиндиазониевым хлоридом. Эти методы используются для определения активности АСТ, просты в исполнении, но требуют редких реактивов.
Слайд 8Аспирин, барбитураты, пенициллин, опиаты, прием пиридоксальфосфата, внутримышечные инъекции завышают результаты исследования.
Необходимо избегать гемолиза, так как в эритроцитах активность фермента в 6 раз выше, чем в сыворотке.
Влияющие факторы
Слайд 9Определение активности АСТ и АЛТ является чувствительным тестом для диагностики инфаркта
миокарда, который не выявляется на ЭКГ, активность АСТ возрастает через 4‑6 часов от начала ангинального приступа, спустя 24‑36 часов достигает максимума и нормализуется на 3‑7 день. Вторичное повышение свидетельствует о повторном инфаркте. Величина активации фермента зависит от обширности поражения миокарда: в тяжелых случаях установлено 20‑кратное повышение активности АСТ и 10‑кратная активация АЛТ.
Клинико‑диагностическое значение
Слайд 10Особенно важное значение имеет определение активности аминотрансфераз для диагностики заболеваний печени.
Некроз или повреждение печеночных клеток любой этиологии (острый и обострения хронического гепатита, холестатическая и обтурационная желтуха, лекарственно-индуцированное поражение) сопровождаются повышением активности обоих ферментов, преимущественно АЛТ, коэффициент де Ритиса = АСТ/АЛТ < 1,33. Уже в продромальном периоде болезни Боткина и у больных с безжелтушной формой гепатита активность АЛТ достоверно возрастает. Выявлены случаи, когда активность АЛТ составила 64 ммоль/ч·л, а АСТ — 27 ммоль/ч·л.
Слайд 11Менее высокое увеличение активности отмечено при циррозе печени, травме скелетных мышц,
миозите, миопатиях, тепловом ударе, миокардите, некоторых опухолях печени, гемолитических болезнях.
Слайд 12Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры
измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Определение проводят по следующей схеме.
Перемешивают и через 60 сек. (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.
Поправку на холостой опыт проводят по формуле:
(ΔΕ/Δt)оп – (ΔΕ/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор.
Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших расчетах.
Ход определения
Слайд 13
Активность, моль/(с∙м3) = нмоль/(с∙л) ґ 106 = Vр.с / ε ґ
1∙Vсыв ґ (ΔΕ / Δt)скор,
где Vр.с — объем реакционной смеси, мл;
Vсыв — объем сыворотки, мл;
t — время реакции, сек.;
ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 сек.;
ε — κоэффициент молярной экстинкции НАДН в м2 ґ моль–1;
1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙102).
Расчет производят по формуле:
Слайд 14Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой
готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Опытная проба включает смесь реактивов — 0,630 мл, сыворотку — 0,10 мл, α-кетоглутаровую кислоту — 0,02 мл. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.
