NGS приложения RNA-Seq. Этапы подготовки образца стабилизация РНК презентация

РНК, выделение РНК, приготовление библиотеки, секвенирование.

quantification: an RNA-seq tutorial by Jochen B.W. Wolf

snRNA, tRNA, piRNA)
4. Антисмысловые и некодирующие РНК
5. Транскриптом одной клетки
6. Транслируемые РНК (РНК-белковые взаимодействия)
7. Двуцепочечные РНК и вторичные структуры на РНК

Применение NGS для исследования РНК

РНК, а кДНК

NGS высокопроизводительное секвенирование. П/ред Д.Ребрикова. М.: Бином, 2014.

обоих концах кДНК

Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics // Nat Rev Genet. - 2009. - Vol. 10, No. 1. - P. 57-63.
Sánchez-Pla A., Reverter F., Ruíz de Villa M.C., Comabella M. Transcriptomics: mRNA and alternative splicing// J Neuroimmunol. - 2012. - Vol. 248, No. 1-2. - P. 23-31.

transcriptomics // Nat Rev Genet. - 2009. - Vol. 10, No. 1. - P. 57-63.

Схема типичного эксперимента RNA-seq

из образца
Шаг 3: Приготовление библиотеки
Шаг 4: Секвенирование
Шаг 5: Анализ данных

Life Technologies—Sample to RNA-Seq. 2012

для выделения РНК
Гибкие условия хранения тканей:
РНК стабильна 1 день при +37°C,
1 неделю при +25°C,
1 месяц при +4°C
и в течение долгого периода при -20°C

RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution
Реагент для стабилизации и защиты клеточной РНК

Форматы: AM7020 - 100 мл
AM7021 - 500 мл
AM7024 - 250 мл

образцов

*Количество исходного материала

Кат.ном.: 12183018A - PureLink® RNA Mini Kit
AM1560 - mirVana™ miRNA Isolation Kit
610-21 - Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit

(dT)25 – суперпарамагнитные частицы с олиго(dT)-последовательностью, ковалентно прикрепленной на поверхности

Метод валидирован для создания транскриптомных библиотек для RNA-Seq при помощи Ion Total RNA-Seq Kit v2

Суперпарамагнетизм — форма магнетизма, проявляющаяся у ферромагнитных и ферримагнитных частиц.

В обычном состоянии не проявляют магнитные свойства, но при воздействии магнитного поля они становятся намагниченными

Total Nucleic Acid Isolation Kit
RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit
for FFPE

Кровь
MagMAX™ for Stabilized Blood Tubes RNA Isolation Kit

Вирусы
PureLink® Viral RNA/DNA Mini Kit

5S субъединицы цитоплазматической рРНК
12S и 16S субъединицы митохондриальной рРНК

• 1 час
• магнитные частицы
• 1-5 мкг или 100 нг – 1 мкг

Данные NGS для универсальной референсной РНК человека до и после удаления рРНК

с рРНК
Удаление рибосомальной РНК за счет взаимодействия биотин-стрептавидин

магнитная
частица со
стрептавидином

биотинилированный
олигонуклеотид-приманка

рРНК

мРНК

рРНК,

состоит из смеси олигонуклеотидов (содержащих по 3 LNA™ мономера*), включающей по 2 специфичных зонда к каждому классу рРНК.

*LNA (locked nucleic acid) - «закрытая» нуклеиновая кислота

Зонды RiboMinus™ для гибридизации с рРНК

кольцо находится в C3’-эндо конформации, благодаря появлению 2’-O,4’-C метиленового мостика; в результате этого происходит «закрывание» рибозы.

Модифицированные таким образом нуклеотиды демонстрируют высокие термостабильность и сродство в дуплексе с целевыми молекулами РНК. 

LNA мономеры в зондах RiboMinus™

зондами

5 мин 37⁰C – гибридизация с частицами со стрептавидином

30 мин – концентрирование РНК на магнитных частицах Nucleic Acid Binding Beads

Отбор супернатанта из образца в магнитном поле (без рРНК)

Рабочий процесс
RiboMinus™ Eukaryote System v2 Workflow

Кат.ном.:
A15020 - RiboMinus™ Eukaryote Kit v2
A15026 - RiboMinus™ Eukaryote System v2

- спецгруппа из академических, частных и общественных организаций.

ERCC - набор контрольной РНК для оценки качества экспрессии генов на различных платформах:
количественная ОТ-ПЦР,
микрочипы,
NGS технологии.

варианта полиаденилированных транскриптов
Размер транскриптов 250-2000 нукл.
«мимикрирует» под естественную эукариотическую мРНК
Используется для оценки точности измерений дифференциальной экспрессии генов
Состав: • 10 мкл ExFold Spike-In Mix 1 • 10 мкл ExFold Spike-In Mix 2 • 1.75мл вода без нуклеаз

Transcript molar ratios in ERCC RNA Spike-In Control Mixes. The transcripts in Spike-In mix 1 and Spike-In mix 2 are present at defined mix 1:mix 2 molar concentration ratios, described by 4 subgroups. Each subgroup contains 23 transcripts spanning a 106-fold concentration range, with approximately the same transcript size distribution and GC content. The controls are ideal for next-generation sequencing experiments.

для получения ориентированной библиотеки кДНК для любых видов РНК

Рекомендации:

1–500 нг поли(А) РНК,
10–500 нг тотальной РНК без рРНК
Тотальная РНК высокого качества (RIN >7)

Ion Total RNA-Seq Kit v2 Publication Number 4476286 Revision E © 2013 Life Technologies Corporation

Может использоваться для анализа как коротких РНК, так и полного набора транскриптов в клетке (транскриптома).

5’-концам РНК за одну реакцию лигирования

В реакцию вступает одна цепь адаптера, причем только с одним из концов молекулы

Направленное и одновременное присоединение адаптеров РНК-лигазой. LEGenD™ Ligase Mix – высокоэффективный фермент, специфически распознающий двуцепочечные молекулы.

кДНК синтезируется с отдельного праймера, комплиментарного 3’-адаптеру

библиотеки кДНК для любых видов РНК

for the preparation of rna libraries US 20140128291 A1

часов

< 5 часов

Магнитные частицы

Магнитные частицы

Магнитные частицы

аминокислот к месту синтеза белка.

snRNA - класс РНК, которые встречаются в ядре эукариотических клеток. Они транскрибируются РНК-полимеразой II или РНК-полимеразой III и участвуют в важных процессах, таких как сплайсинг (удаление интронов из незрелой мРНК), регуляции факторов транскрипции (7SK РНК) или РНК-полимеразы (B2 РНК) и поддержании целостности теломер.

snoRNA - малые ядрышковые РНК считаются подгруппой малых ядерных РНК. Участвуют в химических модификациях (метилировании и псевдоуридилировании) рибосомных РНК, а также тРНК и малых ядерных РНК.

miRNA - малые некодирующие молекулы РНК длиной обнаруженные у растений, животных и некоторых вирусов, принимающие участие в транскрипционной и посттранскипционной регуляции экспрессии генов путем РНК-интерференции.

siRNA - малые интерферирующие РНК или короткие интерферирующие РНК, класс двухцепочечных РНК, Принимают участие в процессах РНК-интерференции, понижая экспрессию специфических генов.

piRNA - наиболее крупный класс малых некодирующих РНК, экспрессируемых в клетках животных; они обнаружены в комплексах с белками семейства Piwi, за что и получили своё название. piРНК обычно длиннее микроРНК и малых интерферирующих РНК и имеют , кроме того, в отличие от микроРНК, они не так консервативны.

от 73 до 93
нуклеотидов

18-25 нуклеотидов
(в среднем 22)

20-25 нуклеотидов

26—32 нуклеотида

Mix v2
• Hybridization Solution
• 2X Ligation Buffer
• Ligation Enzyme Mix
• 3 µL of small RNA sample
(1–100 ng of miRNA in ≤1 µg of enriched small RNA)


Обратная транскрипция

• Nuclease-Free Water
• 10X RT Buffer
• 2.5 mM dNTP Mix
• Ion RT Primer v2
• 10X SuperScript® III Enzyme Mix

выше эффективность обратной транскрипции

(связано с денатурацией вторичных структур РНК при повышении температуры)

+ сниженная RNase H активность
(SuperScript® III RT was engineered to contain mutations that knock out the RNase H activity)

связывание: на частицах задерживаются большие молекулы кДНК (tRNA и rRNA).

2) Второе связывание: целевые продукты кДНК (miRNA и другие маляе РНК) при повышении концентрации EtOH из надосадочной жидкости повторно связываются с частицами.

3) Элюция целевых продуктов кДНК водой Nuclease-Free (37°C).

• Wash Solution Concentrate
• Binding Solution Concentrate
• Nucleic Acid Binding Beads
• Processing Plate
• Nuclease-Free Water

Кат.ном.: AM10027 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)
AM10050 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)

библиотек без баркода:
• Ion 5′ PCR Primer v2
• Ion 3′ PCR Primer v2
• Platinum® PCR SuperMix High Fidelity

Компоненты Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode 1–16 Kit для баркодированных библиотек:
• Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode BC 01 – BC 16
• Ion Xpress™ RNA 3′ Barcode Primer

Platinum® PCR SuperMix High Fidelity – высокоточная полимераза

Кат.ном.: 4475485 - Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode 1-16 Kit

Первое связывание: на частицах задерживаются большие молекулы кДНК (tRNA и rRNA).

2) Второе связывание: целевые продукты кДНК (miRNA и другие малые РНК) при повышении концентрации EtOH из надосадочной жидкости повторно связываются с частицами.

3) Элюция целевых продуктов кДНК водой Nuclease-Free (37°C).

• Wash Solution Concentrate
• Binding Solution Concentrate
• Nucleic Acid Binding Beads
• Processing Plate
• Nuclease-Free Water

Кат.ном.: AM10027 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)
AM10050 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)

Bioanalyzer® instrument with the Small RNA Kit chip

Задать размерные границы продуктов ПЦР:

50–300 bp (все продукты после лигирования)
86–106 bp (для небаркод. библиотек) или
94–114 bp (для баркодированных библиотек)

b. Сколько микроРНК в реакции?

c. Концентрация кДНК?

без баркода:

[Area (86–106 bp)] ÷ [Area (50–300 bp)]

Баркодированная библиотека:
[Area (94–114 bp)] ÷ [Area (50–300 bp)]






Пример:

% miRNA library = (30.3 ÷ 44.5) × 100 = 68%

Всё ОК, идем дальше.


<50% Всё почти ОК,
будет картироваться большее количество нецелевых ридов (без вставки, тРНК, рРНК) по сравнению с уровнем ≥50%.

kit (обновления!)
Конечная концентрация: 11 pM.

Пример:
– The library concentration is 2200 pM.
– The library dilution is 2200 pM/11 pM = 200.
– Therefore, 1 µL of library mixed with 199 µL of Low TE (1:200 dilution) yields approximately 11 pM.

• Ion OneTouch™ 200 Template v2 DL
Конечная концентрация: 14 pM.

Пример:
– The library concentration is 2200 pM.
– The library dilution is 2200 pM/14 pM = 157.1
– Therefore, 1 µL of library mixed with 156.1 µL of Low TE (1:157.1 dilution) yields approximately 14 pM.

sequencing you need to answer your question

RNA similarly creates a library of gene specific assays (up to 300 in a pool) that can be used to measure the abundance of multiple genes at one time by counting fragments using an Ion Torrent sequencer

Доступно 96 баркодов

exon-exon boundary
Designed to detect the maximum number of transcripts assigned to each gene

Дизайн Ion AmpliSeq™ RNA

мин)

Лигирование адаптеров (~40 мин)

Очистка на магнитных частицах (~35 мин)

Амплификация библиотеки (~10 мин)

1 round cleanup

2nd PCR

2 round cleanup

Library quantitation

Quantitation kit (~45-60 мин)
или BioAnalyzer (~35 мин)

Обрезание праймеров и фосфорилирование (~40 мин)

Очистка на магнитных частицах (~20 мин)

Всего ~5 ½ часов

Рабочий процесс Ion AmpliSeq™ RNA

Ion AmpliSeq™ RNA to Detect Fusion Transcripts in Human Cancer Samples. © 2013 Life Technologies

a fraction of the reads cross through the fusion breakpoint

strategy for fusion transcripts
Focus reads around breakpoint
Use optimized design strategy for all fusion transcripts into single custom panel

All reads map to designed breakpoint between fusion gene partners if it is present in sample.
Allows focused concentration of reads on areas of interest for enhanced sensitivity of detection of the fusion transcript.

Cell Panel
243 генов
Факторы дифференцировки и плюрипотентности

RNA Apoptosis Panel
267 генов
Валидированные тест-системами TaqMan®

RNA Custom Panels
До 300 генов на ваш выбор
Дизайн с 1 пулом

Новые панели для анализа экспрессии: AmpliSeq™ RNA Panels

and maintain expected gene expression profiles

Ion AmpliSeq™ RNA Cancer Panel

High correlation between tumor/normal GEx fold change

Ion AmpliSeq™ RNA Apoptosis Panel

High AmpliSeq™ RNA Correlation to TaqMan®

выявление

18 574 кодирующих генов и
2 228 некодирующих генов

на основании аннотации генома человека UCSC hg19

20 802 ампликона (41 604 праймера)
средний размер рида 150 п.о.
1 пробирка.

Кат.ном.:
A26325 Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Kit* 24 rxns
A26326 Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Kit* 96 rxns
A26327 Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Kit* 384 rxns
4471250 Ion Xpress™ Barcode Adapters 1-16 Kit 1 kit

образцов на чипе Proton PI™ Chip.

Измерение кратного изменения экспрессии гена в образцах
Требует 10 нг FFPE общей РНК (истощение по рРНК или полиА+ обогащение не требуется)
Создание библиотек при помощи Ion AmpliSeq™ Kit Plus и баркодированных адаптеров Ion Xpress™ Barcode Adapters
Совместим с системами пробоподготовки Ion Chef ™ и Ion OneTouch™ Systems и секвенаторами Ion Proton™ и Ion PGM™

Gene Expression Kit
and the Ion Proton™ System. A Venn diagram
demonstrating the concordance of genes
identifi ed by MAQC microarray data and the
Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene
Expression Kit.

the
Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene
Expression Kit. The Venn diagram shows the
concordance of significant DEGs between MAQC
microarray and Ion AmpliSeq™ Transcriptome
Human Gene Expression Kit data.