Методы выявления рецепторов: проточная цитометрия, ИФА презентация

3.4.01 Блескин Дмитрий Алексеевич

Москва 2017

Методы выявления рецепторов: проточная цитометрия, ИФА.

качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий.

Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных так и внутриклеточных белков и рецепторов.

флуорисцирующих специфических антител с гомологичным антигеном. Образующийся при этом, комплекс антиген-антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа.

субстрат отыскивают в ткани посредством соответствующей АС.
Непрямой метод применяется при определении антител (антигенов) в жидкостях или в том случае, когда, как упоминалось выше, нет подходящей меченой антисыворотки. Специальной формой непрямого метода является фиксация комплемента антителами.

Методика
Растворы при помощи поршневых пипеток осторожно наносят на препараты, следя за тем, чтобы они были полностью покрыты жидкостью. Инкубацию проводят при комнатной температуре во влажной камере в течение 30 минут. После инкубации растворы отсасывают очень осторожно, чтобы не сдвинуть с места соседние препараты. Отмывают препараты фосфатно-солевым буфером в кюветах, на аппарате для встряхивания. Буфер меняют с различной частотой в зависимости от цели исследования
На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют (химические фиксаторы, лучше ацетон).

минут (однократная смена буфера), высушивают. — Инкубируют препарат с различными разведениями коньюгата. — Препарат промывают ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера). — Препарат высушивают и заключают в подходящий материал.

20 минут (двукратная смена буфера). — Инкубируют с различными разведениями конъюгата. — Отмывают в ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера). — Препарат высушивают, заключают в подходящий материал.

разведения для непрямого метода проверяют титрованием в шахматном порядке с позитивными и негативными контрольными сыворотками.

анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.
Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Методика

нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.
Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
Возможность определения клеточных субпопуляций.
Способность выполнить анализ огромного (до 108 элементов в одном мл дисперсионной среды) количества клеток.
Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и редко встречающихся).
Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции)