La reazione a catena della DNA polimerasi презентация

14:00 -16:00 aula 6A

termociclatori

Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente)

DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi)
- salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente.

Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e medica, nella diagnostica e medicina forense (legale)

Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale).

La reazione a catena della DNA polimerasi

de-novo di nuovi filamenti di DNA da parte della DNA polimerasi di Thermophilus aquaticus
- definizione: reazione ad amplificazione esponenziale con un raddoppio teorico della quantità di DNA ad ogni ciclo di sintesi.

La DNA polimerasi di cosa ha bisogno ?
- del templato denaturato a singolo filamento (forca replicativa?)
dei primers (inneschi)
dei nucleotidi per la sintesi
del tampone
del Magnesio

Reazione a Catena di Polimerizzazione RCP PCR

ssDNA templato, temperatura misurata sulla t° di denaturazione dei primers

3 temperatura ottimale di sintesi della Taq polimerase 72°C che eviti rinaturazione e amplificaz. aspecifiche

alla fine del ciclo prima si doveva riaggiungere la polimerasi

ogni fase del ciclo può durare da 30” ad 1’ o più minuti secondo la lunghezza del frammento da amplificare
(oltre 1’ per più di 2 kb fino a 10’ per 10 kb)

le tre temperature

DNA polimerasi e anche le RNA pol sintetizzano tutte sullo stesso modello di funzionamento:

con il verso 5’- 3’ su uno stampo (templato) antiparallelo 3’-5’
partendo dal 3’ libero di un innesco (primer) appaiato sul templato

anche in vitro si può sfruttare il metodo naturale di sintesi

DNA già era stata usata anche per le reazioni di sequenziamento, ma solo per una delle due eliche

se aggiungiamo un primer sulla catena complementare:

otteniamo una amplificazione di tutte e due le eliche,
e poi ? se la reazione coninua è esponenziale !

due filamenti antiparalleli dovuti al sistema che è stato selezionato in origine con le polimerasi degli acidi nucleici che sintetizzano tutte nello stesso verso 5’ 3’ da un 3’ libero e su un templato 5’ 3’

dopo la sintesi si otterrano 2 doppie eliche identiche alla prima

denaturazione

reazione senza farla fermare ? da sola una doppia elica non si duplica se non si ha la separazione (denaturazione) delle due eliche neosintetizzate !

la tabellina del 2

eliche

5’

3’

3’

5’

pr. rev.

pr. frw.

= seq +

+

_

= seq -

Il ciclo (non il velocipede)

un raddoppio di DNA, ma dipende dalla messa a punto del protocollo di reazione, molte variabili da ottimizzare

- senza contaminazioni amplificazione da quantita’ minime di DNA (famtogrammi o singole cellule)

- genoma diploide 2 doppie eliche di templato in interfase

II CICLO 4 eliche

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

5’

Denaturazione

III CICLO

8 eliche

16 eliche

5’

3’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

32 eliche…..

IV ciclo

Ciclo continuo

3 passaggi (fasi)

I passaggio denaturazione (5-10 min. quella iniz. della reazione)

II passaggio appaiamento dei primers (annealing)

III passaggio di sintesi del DNA,
estensione del filamento di DNA a partire dai primers (inneschi)

Fine del ciclo

Alla fine dei cicli programmati viene fatta una estensione di 5 -10 min. per assicurare il completamento della sintesi di tutti i nuovi frammenti iniziati e non terminati

Le condizioni di reazione di ogni passaggio

che aumentano la specificità, efficienza e lunghezza del frammento amplificato

il DNA templato sufficientemente purificato se genomico ad alto peso molecolare

i primers di sintesi prodotti da ditte specializzate (15-25 bp)

la concentrazione del Mg di solito 1,5 mM

il Buffer ottimale per la polimerasi

H2O per portare al volume finale di reazione ~ 50 microlitri

i reagenti della reazione enzimatica

per una preparativa.
Il DNA (templato), abbastanza pulito, non deve essere purissimo, la quantita’ puo’ essere molto poca, normamlmente si usano 10-100 ng di un genoma eucariotico, più di 500 ng possono inibire della reazione

La Taq polimerasi, DNA polimerasi di “thermophilic eubacterium thermus acquaticus” resiste a 95°, frequenza di errore superiore a quelle di eucarioti,
26 x10- 6, ora ce ne sono per diverse finalita’, a basso tasso di errore = high fidelity 8.5 x10- 6, e per frammenti lunghi genomici. Se ne usa da meno di 1U fino a 5 U, ma se si fanno molti cicli conviene spezzare la reazione in due fasi e riaggiungerla

dNTPs: conc. standard 100 μM per ognuno

Il tampone: sale di Tris, il Mg concentrazione empirica tra 0. 5 mM e 4. 5 mM, ogni Taq pol. ha un tampone con concentrazioni saline (buffer) ideali

I primers: scelti per funzionare in coppia, evitare GC ed AT finali, palindromi, sequenze complementari, devono avere TM(melting) simili,

H2O q.b. sterile incontaminata per arrivare al volume finale

Le componenti per la reazione:

a cui sono stati attaccati dei primers tramite ligasi e che fanno da inneschi, prima per la PCR e poi per la reazione di pirosequenziamento delle palline collocate nelle celle in cui entra una pallina solamente.
La reazione è colorimetrica tramite un metodo che vedremo più avanti

nel caso del pyrosequencing

sul tema PCR multiplex

Real Time PCR abbreviata = RT-PCR da non confondere

AFLPs
(uso di adapters anche col random sequencing e PCR)

Mutagenesi

Pcr quantitativa e semiquantitativa competitiva

3C = chromosome conformational capture e varianti

nel genoma


Cosa cambia?

recombination ha regioni limitrofe ignote b)


Due tipi di PCR per poter fare l’analisi delle regioni limitrofe

PCR classica con primers interni ed esterni alla regione che ricombina col vettore
b) PCR inversa per identificare le regioni limitrofe

degli enzimi

- nuove macchine con determinazione in tempo reale (real-time PCR) tramite laser (light-cycler) del DNA o cDNA amplificato proporzionale al templato iniziale presente nel campione in analisi.

Questa è la PCR quantitativa, diversa dalla PCR semiquantitativa o competitiva.

La PCR quantitativa da un valore assoluto rispetto ad un amplicone di riferimento a quantità nota con la così detta curva di taratura da cui si ricava un c/t value (threshold cycle)

mRNA

RT-PCR è il metodo per determinare l’espressione o meglio la trascrizione di un gene

- alternativa all’analisi Northern ma non determina la lunghezza del mRNA, solo la presenza e volendo la quantità trascritta

un cDNA

devo fare prima una retrotrascrizione con random priming con esanucleotidi

e poi la PCR per vedere se il gene è espresso (trascritto)
esperimento sostitutivo di un Northern, ma non dice la lunghezza del messaggero

i primers come li scelgo ? : sulla sequenza coding che è quella depositata in banca dati e che non è il cDNA che sarebbe il DNA complementare all’mRNA dopo retrotrascriz.

quindi si selezionano i primers come per una normale PCR purchè si abbia la sequenza corrispondente a quella coding = al mRNA = sequenza codificante (quella in banca dati)

scoperti i meccanismi molecolari con cui i virus ad RNA si replicavano all’interno delle cellule infettate.

Le più utilizzate sono quelli della Murine Moloney leukemia virus MMLV, Avian myeloblastosis virus AMV che poi sono state anche trasformate per resistere meglio ad alta temperatura per fare la “one step RT-PCR”

Oltre alle RT anche le Taq polimerasi sono state migliorate per efficienza ed affidabilità (riduzione di errori di sintesi).

o isolamento di un cDNA senza Northern blot o screening di una cDNA library (si deve avere una sequenza nota).

La RT-PCR: da RNA totale di cellule per verificare che sia trascritto quel particolare gene. Basta una quantità di RNA molto piccola a differenza di un northern dove per ogni corsa ci occorrono 2-3 μg di poly A mRNA o 7-10 μg di RNA totale. Nel caso di una cDNA library la quantita’iniziale di RNA e di lavoro e’assai maggiore.

RT-PCR classica:
- Primo filamento o con primer di oligo dT o random priming con esanucleotidi. - L’enzima funziona a 37°C; mutanti resistono fino a 60°C.
Si retrotrascrive tutto l’mRNA o tutto l’RNA, nel caso in cui i trascritti siano molto lunghi e l’enzima potrebbe non completare la retrotrascrizione a partire dal polyA.
- Dall’RNA va eliminato il DNA genomico.
- Dopo la sintesi del primo filamento di DNA si puo’ far partire una normale PCR, ma si fa un trattamento di RNase per eliminare l’RNA, gli esanucleotidi e l’oligo dT; ci sono protocolli in cui si fa un’unica reazione perche’ la temperatura della PCR e’ selettiva e la Taq hot-start non si attiva prima di essere portata oltre 70°C.

DNA
e si puo’ fare un trattamento di DNAse,
e/o scegliere i primers a cavallo di due esoni

I filamento con rev transcript. a bassa temp.

II filamento con Taq polymerase, I coppia di primers
(sulla sequenza del mRNA). Non si vede tutto il trascritto, come in un Northern, non se ne puo’ valutare il peso, ma solo se quel frammento e’ trascritto (cioe’ se c’e’ quel mRNA), non si vede lo “splicing” alternativo salvo scelta dei primers su esoni diversi

Valgono tutte le cose che si sanno per la PCR compreso rischio di amplificazioni aspecifiche, la reazione va messa a punto ogni volta.
A differenza del Northern la buona amplificazione del frammento (amplicone) puo’ dipendere non solo dal fatto che c’e’ molto mRNA, ma anche dall’efficienza della PCR, quindi così non e’ quantitativa.

Per avere un cDNA (DNA complementare ad un RNA messaggero) si deve retrotrascrivere l’mRNA cioe’ farlo diventare DNA

I retrovirus ad RNA fanno la sintesi del DNA complementare al loro cromosoma ad RNA tramite una DNA polimerasi specifica che usa come templato RNA anziche’ DNA.

Pero’ sempre con la sintesi in direzione 5’-3’come ogni polimerasi.

L’enzima “reverse transcriptase” o trascrittasi inversa che si utilizza non e’ termoresistente, ma deriva da un retrovirus eucariotico, AMV avian myeloblastosis virus, M-MuLV Moloney leukemia virus murino ed anche altri. Piu’ recentemente sono state isolate e clonate delle RT mutanti che resistono a temperatura piu’ alta di 37°C fino a 60°C per aumentare specificità.

Le tecniche precedenti per lo studio della trascrizione erano l’analisi Northern e l’isolamento dei cDNA da libraries clonate in vettori vari.

determinazione del PM dei trascritti (Northern)

Analisi dei livelli di trascrizione più fine per la sensibilità del metodo, se si vedessero tramite Northern le stesse quantità il Northern sarebbe più informativo (anche PM)

Ampliconi possibilmente a cavallo di introni, perché ?

Analisi a partire da piccole quantità di RNA totale,

svantaggio: non si sa la lunghezza del cDNA o mRNA

cDNA ( DNA complementare all’ mRNA)
Si parte da estratti di RNA totali o arricchiti per poly +(A) su resina con oligo dT
La retrotrascrizione può avvenire con primers di esanucleotidi random o con poly T, a seconda della lunghezza dei trascritti e se si vogliono tutte le regioni trascritte o sempre a partire dal 3’ poliadenilato.
RNA è molto instabile e vanno usati degli inibitori delle Rnasi per evitare che si degradino. Il cDNA è molto più stabile e si conserva meglio e più a lungo.

Il cDNA si utilizza per la PCR però c’è un solo filamento complementare al trascritto con senso 5’-3’ inverso.

retrotrascrivere il cDNA si tratta l’RNA con DNAse per eliminare ogni traccia di DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi.
Ottenuto il cDNA dalla reverse trascrittasi si passa alla PCR vera e propria con i primers specifici della regione del messaggero che vogliamo amplificare.
Come accorgimento si può (si deve quando è possibile) amplificare un amplicone che comprende due porzioni di due esoni diversi e così non si amplifica il frammento di DNA genomico che è molto più lungo in quanto contiene l’introne.
Naturalmente la lunghezza dell’amplicone è sempre ragionevole e non c’è nessun bisogno di amplificare esoni interi, ma sequenze dalle 150 alle 500 pb.

sequence con esoni ed introni

5’

3’

corrispondono agli attesi

Quando i prodotti non sono gli attesi:


Smear - poca specificità nonostante i primers specifici

si gioca sulla temperature di “annealing”, temp. su

cicli troppo lunghi rendono aspecifica l’amplificazione


Bassa amplific. - stringenza “annealing” alta, temp. giù

- ciclo troppo corto, allungare tempi di annealing o extension

Ritocco dei parametri del protocollo, le variabili, il ciclo,

PCR :
la seconda interna alla prima = nested PCR

se abbiamo provato ad ottimizzare in ogni modo la nostra PCR e vediamo che si amplificano altri frammenti si prova a fare una seconda PCR sul primo prodotto con nuovi primers

amplificazioni aspecifiche, peso molecolare diverso dall’amplicone prescelto

50
ATTTTGAAAT CTGATTCCTT TTCTGAGCAT GTATCAGTCT GACTAGACAC
TGAGTCCTGT CTGATTTCTG AGCCTTGGCC CTCATGAGTA AGTGACCTGC
AGTGGTGGAG GGAGCTCCAG GGGAGCCGAG ACCCTCTCAG TGCATGTACT
CACTGGTAGA TGAAGAAATG ACCCCAATGA TTGCTCCATT CTTCCAGGCT
CAGAGGGGTG TGTAGGCCCC AGGAGGACTT GGTGGGGAGA AGACCAGCCC
AGGCCCTGTG AGTACACCCA GCCCCAGCCC CTAAGGGGTC GCCAGGTCTC
GACTTAGCAC TGGGGAGGGG GTACAGTACA GGAGTGGGGA CAGGAAGGTG
AGGGGAGGCC ATGCCGTTTG TATTCTCTTG CTTTTCTCTC TCTCCTGAAG
CCTCTTGAAT AGACCTGCAG AAATACCCAA AATAGCCCTG TGGGGTGGCT 500
GAGTCATTGT GAACACAGCC CAGGTCAGGT GTTCCAGCCA GAGAACTGCT
GTTCTGAGAA ACATGCCCCA AAACCGAGAC CTGGCCAGGT GTGCCTGGGG
CCTGAGCGAG GGGCTGCAGC CACAGGTAGG CCCAGCCCCA ACCAGCCCAG
AGTCAGCTAG GGCTTTCCAG GTCCAGGGTT AGGCAGAGGT CAGCCAGGGT
CAACCACGGT CTATCTGAGG GGAGAGACAA GAGACACAGA GACATAGAGA
GAGAGAGACA GGGATGGGGA GAGACAAGAG AGACAGGAAA GGAGAGACAA
AGACAGACAC AGAGAGAGAG ATGGGGATGG AGAGAGATAA GAGACAGGGA
CAGGGAGGGA CAGAGGCGAG GCCAGTGACA GAGACAGAGT TACAAGAGAC
AGAAAGAGAG AGAGATGAGA TGAGAGAGAT CAGAAGAAAC GGAGACACAG
ATGGGAGAAA AAGAGAGGAG ATGGGAACAG GAAAAAGAGA CATGGAGACA 1000

I coppia rossa amplicone + lungo
II coppia celeste nested amplicone + corto

calcolate:
la T°C e lunghezza
ampliconi
da bp a bp

scrivete i
primers
da 5’ a 3’

ctccatgcat ttggtatttt
61 cgtctggggg gtgtgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc 1frw
121 gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatt ctattattta tcgcacctac gttcaatatt 2frw
181 acaggcgaac atacctacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata
241 acaattgaat gtctgcacag ccgctttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca
301 aacccccccc tccccccgct tctggccaca gcacttaaac acatctctgc caaaccccaa
361 aaacaaagaa ccctaacacc agcctaacca gatttcaaat tttatcttta ggcggtatgc
421 acttttaaca gtcacccccc aactaacaca ttattttccc ctcccactcc catactacta
481 atctcatcaa tacaaccccc gcccatccta cccagcacac acacaccgct gctaacccca
541 taccccgaac caaccaaacc ccaaagacac cccccacagt ttatgtagct tacctcctca
601 aagcaataca ctgaaaatgt ttagacgggc tcacatcacc ccataaacaa ataggtttgg
661 tcctagcctt tctattagct cttagtaaga ttacacatgc aagcatcccc gttccagtga
721 gttcaccctc taaatcacca cgatcaaaag ggacaagcat caagcacgca gcaatgcagc 2rev
781 tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc agtgattaac ctttagcaat
841 aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg tcaatttcgt gccagccacc
901 gcggtcacac gattaaccca agtcaataga agccggcgta aagagtgttt tagatcaccc 1rev
961 cctccccaat aaagctaaaa ctcacctgag ttgtaaaaaa ctccagttga cacaaaatag
1021 actacgaaag tggctttaac atatctgaac acacaatagc taagacccaa actgggatta

determinare lunghezza posizione T melting dei primers
lunghezza ampliconi = da bp n.x a bp n.y e posizione

è venuto bene)

Cosa è il controllo negativo? E quello positivo?
A cosa servono?

Rischio contaminazione (il DNA templato potrebbe essere presente nell’ambiente dove si esegue l’esperimento)

Perché si ha contaminazione ?

priming con esanucleotidi,

dal cDNA in poi PCR

sistemi onnicomprensivi con entrambe le reazioni

PCR con primers esonici

Primers: le stesse condizioni di scelta di PCR diretta

a differenza del Northern si può usare quantità minime di RNA

vedere con RT-PCR: la trascrizione di un gene

come eliminare il DNA: con estrazioni specifiche con gradiente in ClCs o con solventi specifici (Guanidina)

dopo l’estrazione trattamento con DNAse

scelta di primers su esoni diversi: il DNA contaminante ha peso molecolare maggiore (introni)

di templato

l’amplificazione è proporzionale alla quantità iniziale

dopo un certo numero di cicli c’è saturazione

saturazione = impossibilità di rilevazione delle differenze o di crescita lineare del prodotto di amplificazione, si perde la proporzionalità di amplificazione e quindi una risposta di tipo quantitativo, resta solo una indicazione qualitativa.

la proporzionalità anche dopo molti cicli di amplificazione ?

rispondete perchè già lo sapete!

il DNA amplificato come intensità di banda

RNA non retrotrascritti

se si amplifica cosa vuol dire?

altro controllo positivo nel caso che il trascritto sia assente o debolissimo:

amplificazione con primers per un gene house-keeping

campioni indipendenti
univocità di amplificazione col protocollo ottimizzato

Controlli di contaminazione: quali?
a. estrazione di controllo con i prodotti di estrazione
assenza di amplificazione su a.
b. assenza di amplificazione
su tutti i prodotti di reazione della PCR:
primers
taq polimerase
nucleotidi
tampone
acqua di diluizione

vuole identificare l’intero cDNA e non si conosce e si vuole evitare lo :screening” di una “library” si può ricorrere alla RACE

di sequenze nucleotidiche, usando come stampo un mRNA tra una ben definita regione interna ad esso ed una sua estremità (3’ o 5’).

Questa tecnica, nota anche come “one-sided” PCR o “anchored” PCR, puo’ essere considerata una variante della più classica PCR.

Principi della RACE

random

cDNA primo filamento prodotto dalla RT (completi e non)

5’

5’

TTT

3’

3’

3’

5’

I cDNA ottenuti possono avere estremità diverse a secondo
dell’efficienza della RT, e dei primers usati

per sintetizzare il cDNA
-Prima della RT si può effettuare una reazione di DNase per eliminare il DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi perché contamina l’ RNA e successivamente il cDNA
-Dopo la reazione di RT si può fare una reazione di RNase per eliminare RNA

RT = reverse transcriptase / trascrittasi inversa

cDNA

5’

3’

TTTTT

regione nota

regione ignota

esempio EXON e PROMOTER
TRAPPING);

Dall’IBRIDAZIONE con sequenze conservate evolutivamente
e/o funzionalmente.

Cosa serve per fare la RACE

con
primer oligo dT

TTTTTT

5’

3’

trattamento con RNase

PCR con primer frw. noto e primer rev. con
coda aggiunta

TTTTTT

5’ noto

3’

5’

prim rev.

prim.frw

TTTTTT

3’

5’

3’ ignoto

Race ricerca del 3’ ignoto

è quello per la RT (poly T)
Il secondo primer viene scelto nella regione nota e deve essere specifico

cDNA

5’

3’

TTTTT

regione nota

regione ignota

primer specifico

Una amplificazione con un solo primer specifico potrebbe dare dei prodotti anche aspecifici.
Quale strategia si può adottare ? Esiste una possibilità per aumentare la specificità di reazione, per ottenere il prodotto specifico corrispondente a ciò che sto cercando ?

dell’mRNA e un primer contenente una coda di oligo(dT) all’estremità 3’ e retrotrascizione

5’

AAA….AAA

n

TTT…..TTT

5’

3’

RACE 3’

secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione interna a quella nota e più al 5’ del cDNA e cioè più al 3’ nella regione nota dell’ mRNA (coding sequence)

La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al primo primer,
si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione,
probabilità alta di avere un frammento specifico
probabilità bassa che due sequenze omologhe siano limitrofe due volte nel genoma.
- in casi estremi si può ricorrere ad un terzo primer interno.

libero su un templato

la polimerase estende da un 3’ libero purchè appaiato

5’

3’

3’

5’

poco importa se ha una parte al 5’ non appaiata, verrà inglobata lo stesso nell’amplicone e ne farà parte dalla amplificazione successiva in cui serve da templato

usando un primer specifico del gene (GSP) ed uno specifico alla nuova estremità 5’(AUAP o UAP)

3’

…e la specificità???

gsp = gene specific primer
Uap = universal amplification primer
Auap = abridget univ.ampl. primer

Race fasi successive

un secondo primer gene specifico (GSP2)

Specificità GSP2

I primers UAP e AUAP servono per avere delle T melting su cui disegnare i GSP

il verso dei primers interni alla regione nota ed il primer del 3’ ignoto può essere anche un poly T con una coda per avere una T° melting più consona ai primers interni

Solammente il primer della seq
nota si può cambiare con un
secondo più interno

mRNA

5’

3’

AAAA

RT reverse trascrittasi

cDNA

3’

TTTT

5’

RACE 3’

I filamento

I filamento

5’

TTTT

3’

seq nota

amplicone finale contenente il 3’ ignoto

I prim

II prim

II filamento

AAAA 3’

5’

prim esterno con coda
eventuale

TTTT

utiliziamo gli stessi metodi utilizzati per ottenere il cDNA della ricerca del 3’ ignoto. C’è anche la possibilità di fare la RT direttamente con un primer noto. L’unico problema è che pochi sono gli enzimi RT che funzionano ad alta temperatura per cui è possibile che il primer specifico non faccia una RT molto specifica. Per questo motivo si tende a fare una RT di tutti i messaggeri (retro-trascrittoma).
Dopodichè si deve fare una terminal transferasi come spiegato nelle diapositive successive, si preparano dei primers con una coda che possono aumentare l’efficienza rispetto al primer poly C. Si devono usare invece i primers interni specifici nested in maniera simile alla RACE 3’.

un primer gene specifico (GSP1); oppure con poly T o random priming (esanucleotidi random).

GSP1

NON deve essere interno o sovrapposto ad introni;

NON deve avere una Tm molto alta (lavora circa a 42°C);

NON deve avere una bassa specificità o omologia con altri geni;

Race 5’ fase I

del cDNA

3’

5’

CCC….CCC

Race 5’ fase II

singolo filamento

rev. transcript. a temp. restrittiva con enzima mutante RH-

trattamento con RNase

5’

3’

cDNA singolo filamento

trattamento con terminal transferase

CCCC

primer frw di poly G

5’

3’

cDNA singolo filamento

CCCC

sintesi secondo filamento

PCR selettiva

c

c

c

c

c

c

c

c

c

c

primer rev. specif.

race 5’ignoto riepilogo

transferase, PCR selettiva con II primer rev. selettivo interno

5’

3’

CCCC

I primer rev. specif.

5’

3’

II primer rev. spec.
interno (nested)

GGGGG

CCCCC C

5’ sconosciuto

II primer rev. spec.
interno (nested)

Clonaggio in un vettore per inserzione con estremita’ coesive per restrizione dell’adattatore o con A-T

Race 5’ ricapitolazione

hanno aggiunte di A terminali spuri
TAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends”
Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato.

Esistono in vendita:
- plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la ligasi tra l’amplicone ed il plasmide
- plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi

Clonaggio dei prodotti PCR