Слайд 1Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального
образования
«Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого»
Институт медицинского образования
“Иммунофлюоресцентный анализ”
Выполнили: студенты группы 6324
Салманов Иса Хабибулаевич.
Великий Новгород
2017г.
Слайд 2
Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувствительных методов выявления связывания антител с
антигенами в клетках и тканях — иммунофлюоресцентный анализ. Специальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикрепляется химической связью к молекуле специфического антитела, не нарушая его специфичности. Часто используют краситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеленой флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлю- оресцентного метода, активируются светом одной длины волны (чаще — ультрафиолетовой части спектра), а сами испускают лучи другой длины волны (видимого спектра). В люминесцентном микроскопе используется в качестве источника света, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.
Слайд 3
Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного
микроорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его называют методом экспресс-диагностики.
Слайд 4
Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических
антител против каждого из изучаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой иммунофлюоресцентный метод, при котором связанные с антигеном специфические антитела (немеченые) выявляются с помощью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген-специфические антитела.
Слайд 5
Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент
(например, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разложения, видимые в обычный световой микроскоп.
Слайд 6
Для использования при электронной микроскопии антиген- специфические антитела можно метить частицами
золота, локализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.
Слайд 7
При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с
микробными антигенами, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов
Слайд 8
Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей
антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечивая его свечение при люминесцентной микроскопии.
Слайд 9
На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени
и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген—антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связывающихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген—антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.