Слайд 1Генетика мікроорганізмів. Мінливість бактерій. Мікробіологічні основи генної інженерії і біотехнології.
ВНМУ
ім. М.І.Пирогова
Кафедра мікробіології
Слайд 2Організація генетичного апарату бактерій
Геном - вся сукупність генів у бактеріальній клітині.
Ген – це фрагмент молекули ДНК, що кодує послідовність амінокислот в поліпептидному ланцюзі, яким обумовлюється певна ознака окремої особини
Слайд 3
Генотип - індивідуальні спадкові властивості і ознаки мікроорганізму, зумовлені індивідуальним геномом
Фенотип
– це зовнішні прояви результату взаємодії бактерії із оточуючим середовищем, які знаходяться під контролем генотипу
(індивідуальний прояв генотипу)
Слайд 4Особливості генетики бактерій
Геном бактерій складається із хромосоми і позахромосомних елементів
Хромосома бактерій
представлена кільцевою молекулою ДНК, що містить від 400 до 4000 генів (виключення –B.burgdorferi, хромосома якої є лінійною)
Слайд 5Особливості генетики бактерій
Хромосома бактерій знаходиться у цитоплазмі у вільному стані, в
супер- спіралізованій формі
Бактерії є гаплоїдними організмами, але вміст ДНК в клітині в певних станах може досягати кількості 2,4 або 8 хромосом
Передача генетичної інформації у бактерій здійснюється як по вертикалі (дочірнім клітинам), так і по горизонталі (в процесі генетичних рекомбінацій)
Досить часто бактерії мають позахромосомний плазмідний геном, який надає їм важливих біологічних властивостей
Слайд 6Позахромосомний генетичний матеріал бактерій
Плазміди – кільцеві молекули ДНК, які містять до
40 генів, і стабільно спадкуються клітиною в позахромосомному стані
Транспозони- дрібні, не здатні до самовідтворення позахромосомні молекули ДНК, які містять від 4 до 10 генів
Вставні послідовності (IS-елементи) – короткі ланцюги ДНК, які самостійно не реплікуються і не кодують фенотипових ознак, але здатні регулювати активність генів хромосоми, вільно пересуваючись з однієї її ділянки до іншої
Слайд 7Класифікація плазмід
В залежності від місця розташування:
Автономні – не пов’язані з хромосомою
кільцеві молекули ДНК, що самостійно реплікуються в цитоплазмі бактерій.
Інтегровані- вбудовані у хромосому і реплікуються разом з хромосомою.
Слайд 8Класифікація плазмід
В залежності від шляхів поширення від однієї клітини до іншої
Трансмисівні
( R- і F-плазміди )-передаються шляхом кон’югації.
Нетрансмісивні – знаходяться у великій кількості в клітини (до 30), що забезпечує їх довільний розподіл у дочірних клітинах.
Слайд 9Класифікація плазмід
За біологічними властивостями, що кодуються:
R-плазміди (від англ. resistance – стійкість)
– містять r-гени і RTF-фактор, які зумовлюють резистентність бактерій до протимікробних препаратів і здатність до передачі в процесі кон’югації
F-плазміди і Hfr-фактори (від англ.fertility- родючість, high frequency of recombination- висока частота рекомбінацій) – кодують синтез спеціальних F-пілей, необхідних для кон‘югації, зумовлюють прискорений поділ бактерій.
Слайд 10Класифікація плазмід
Col- плазміди – плазміди, що кодують синтез біологічно активних сполук
(бактеріоцинів), відповідальних за явище мікробного антагонізму між спорідненими видами
Tox- плазміди – плазміди патогенності, які містять tox-гени, що надають бактерії здатності синтезувати токсини
Ent – плазміди- плазміди патогенності, що зумовлюють синтез ентеротоксину
Слайд 11Класифікація плазмід
Hly– плазміди – містять гени, які кодують синтез мембранотропних токсинів
(гемолізинів)
Плазміди біодеградації – надають бактеріальній клітині властивостей синтезувати ферменти, що розщеплюють природні і синтетичні сполуки, і використовувати їх як джерело енергії або пластичного матеріалу
Криптогенні плазміди – роль цих плазмід у життєдіяльності бактерій не з‘ясована
Слайд 12Функції плазмід
Регуляторна функція – плазміди компенсують дефекти метаболізму бактерій шляхом вбудовування
в ушкоджений геном
Кодуюча функція –внесення в мікробну клітину нової генетичної інформації, яка зумовлює появу нових біологічних властивостей, що сприяє виживанню бактерій у змінених умовах середовища
Слайд 13Мінливість бактерій
Фенотипова (модифікаційна) мінливість або модифікації виникає під впливом факторів зовнішнього
середовища і не супроводжується змінами у генетичному апараті
Генотипова мінливість (мутації і генетичні рекомбінації) зумовлена змінами у генетичному апараті бактерій
Слайд 14Види модифікацій
Морфологічні модифікації
Приклад: поява нестабільних L-форм під впливом пеніцилінів; виникнення інволюційних
форм бактерій у старих культурах.
Біохімічні модифікації
Приклад: синтез індуктивних ферментів за умови наявності відповідного субстрату в середовищі
Дисоціація форма внутрішньопопу-ляційної мінливості, яка проявляється появою особин, що відрізняються від початкового типу культуральними, біохімічними, морфологічними та антигенними ознаками
Слайд 15Характеристика дисоциатівних форм бактерій
Слайд 16Генотипова мінливість
Мутації – зміни в первинній структурі ДНК клітини, які супроводжуються
стійкою стрибкоподібною зміною певної біологічної ознаки і стабільно успадковуються наступними поколіннями
Генетичні рекомбінації – зміни в генотипі бактерій, які зумовлені передачею фрагменту геному однієї клітини (донор) до іншої (реципієнт), і супроводжуються появою нових ознак у рекомбінанта
Слайд 17Класифікація мутацій
Спонтанні мутації зумовлені дією ендогенних чинників :
помилки ферментів в процесі
реплікації ДНК
взаємодія хромосомної ДНК з позахромосомними елементами (транспозонами, IS-елементами)
частота виникнення - 10 -7 -10-9
Індуковані мутації виникають під впливом направленої дії на геном бактерій екзогенних чинників або мутагенів
частота виникнення – 10-4 – 10-5
Слайд 18Класифікація мутагенів
Фізичні мутагени:
Іонізуюче випромінювання сприяє утворенню димерів пиримідину, що ускладнює процес
розподілу ДНК на 2 нитки і призводить до обриву ДНК в процесі реплікації
Ультрафіолетове випромінювання викликає утворення димерів тиміну, що зумовлює помилки в генетичному коді при реплікації ДНК
Слайд 19Класифікація мутагенів
Хімічні мутагени:
Аналоги азотистих основ (напр., бромурацил) включаються в молекулу ДНК
замість подібної за структурою азотистої основи і при реплікації зумовлюють вставку невідповідної основи
Алкілуючі речовини (напр., етілметансульфонат) викликають модифікацію азотистих основ
Нітрозосполуки і азотиста кислота дезамінують азотисті основи
Акридинові барвники вбудовуються між азотистими основами, що призводить до втрати нуклеотидів або вставки додаткової пари в процесі реплікації
Слайд 20Класифікація мутацій за величиною ділянки ДНК, що зазнала змін:
Точкові мутації виникають
в межах одного триплету:
делеція
вставка
модифікація
Лінійні (генні) мутації - це зміни ДНК в межах гену
Делеція
дуплікація
інверсія
Транслокація
Геномні мутації пов‘язані з змінами одного або декількох генів
Слайд 21Класифікація мутацій за фенотиповими наслідками:
Летальні
Умовно-летальні
Нейтральні
Класифікація мутацій за місцем виникнення:
Хромосомні
Позахромосомні
Слайд 22Генетичні рекомбінації
Генетичні рекомбінації – це обмін генетичною інформацією між двома спорідненими
бактеріальними геномами
Види рекомбінацій:
Трансформація
Кон'югація
Трансдукція
Слайд 23Трансформація
Трансформація це процес включення у геном клітини реципієнту поглинутих фрагментів донорської
ДНК (хромосом-ної або плазмідної)
Умови для здійснення:
компетентність реципієнту
гомологічність донорської ДНК (близька генетична спорідненість донора і реципієнта)
наявність двохниткового фрагменту ДНК
велика молекулярна маса фрагменту ДНК
Слайд 24Стадії трансформації
Адсорбція ДНК на клітині реципієнта
Фрагментація донорської ДНК клітинними ендонуклеазами
Проникнення фрагментів
ДНК у цитоплазму реципієнта
Руйнація одної нитки ДНК
Рекомбінація однониткових фрагментів ДНК з ДНК реципієнта
Утворення рекомбінанта
Слайд 25Кон'югація
Кон’югація – процес обміну генетичним матеріалом при безпосередньому контакті клітини донора
(F+ або Hfr+) і реципієнта
Умови для здійснення:
наявність у клітини донора F- плазміди або Hfr-фактора
як правило, спорідненість генотипу донора і реципієнта
Слайд 26
Умови для здійснен-ня (продовження):
наявність позахромосомних генетичних елементів, які передаються від донора
до реципієнта
Слайд 27Трансдукція
Трансдукція – процес передачі фрагментів ДНК донора до клітини реципієнта за
допомогою бактеріофагів
Види :
специфічна
неспецифічна
абортивна
Необхідною умовою для здійснення трансдукції є наявність бактеріофагів, які перед тим, як інфікувати клітину-реципієнт, репродукувались в донорській клітині
Слайд 28Види трансдукції
Неспецифічна виникає внаслідок передачі будь-якої ділянки ДНК донора, випадково включеної
в голівку бактеріофагу
Специфічна зумовлена передачею певних ділянок ДНК донора за допомогою помірних дефектних фагів
Абортивна – варіант специфічної трансдукції, коли ДНК дефектного фагу не вбудовується в ДНК реципієнта, а вільно розташовується в цитоплазмі
Слайд 29Інші види рекомбінацій
Трансфекція – варіант трансформації бактеріальних клітин без клітинної стінки
за участю вірусної (фагової) ДНК.
В генній інженерії трансфекцією також називають введення будь-якої чужорідної ДНК в клітини еукаріотів і прокаріотів
Сексдукція – перенесення генетичного матеріалу від донора до реципієнта за допомогою F`-плазміди
F`-плазміда – це попередньо інтегрована у хромосому бактерій F-плазміда, яка під час вирізання із хромосоми випадково може захопити від одного до кількох генів із бактеріальної хромомсоми
Слайд 30Генетика вірусів
Особливості вірусного геному:
Містить тільки один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або
РНК)
Гаплоїдність, що зумовлює негайне потрапляння мутантів під контроль природного відбору (диплоїдний геном мають тільки ретровіруси і реовіруси)
Мала ємкість геному (від 3 до 200 генів).
Існування різних механізмів підвищення ємкості вірусного геному (перекривання геному, наявність декількох рамок зчитування, сегментація та інше)
Слайд 31
Генофонд вірусних популяцій поповнюється і змінюється внаслідок:
Мутацій (напр., антигенний дрейф у
вірусів грипу)
Рекомбінацій між спорідненими РНК вірусами із сегментованим геномами (напр., антигенний шифт у вірусів грипу)
Рекомбінацій в межах геному двохниткових ДНК вірусів
Рекомбінацій з геномом клітини хазяїна (можливо для онкогенних вірусів, які вбудовують власний геном у геном інфікованої клітини)
Слайд 32Фенотипові прояви вірусних мутацій
Зміна чутливості вірусів до температури
Зміна чутливості до противірусних
хімічних агентів
Зміна вірулентності
Поява здатності розмножуватись в інших клітинах (зміни в рецепторному апараті вірусу)
Зміни в швидкості репродукції в інфікованих клітинах
Зміна типу взаємодії вірусу з клітиною хазяїна
Зміна антигенної структури
Слайд 33Генетичні рекомбінації у вірусів
Здійснюються за наступними механізмами:
Перехрещення (кросінговер) – у ДНК
вірусів в результаті кросінговеру двох дефектних геномів може з’явитись один повноцінний
Транскрипція “у вигляді стрибка” при копіюванні однієї нитки РНК РНК-полімераза може “перестрибнути” на іншу нитку і продовжити процес транскрипції
Обидва шляхи ведуть до відновлення повноцінного геному, що має назву генетична реактивація або перехресна реактивність
Слайд 34Генетичні рекомбінації у вірусів
Транслокація – обмін окремими сегментами геному між спорідненими
вірусами при одночасному знаходженні в інфікованій клітині (антигенний шифт)
Інсерція з наступною делецією відбувається при інфікуванні клітини вірусами, які здатні вбудовувати свій геном у геном хазяїна (інсерція). При вирізанні вірусного геному (делеція) випадково можуть захоплюватись ділянки ДНК хазяїна
Останні 2 механізми рекомбінації відбува-ються між різними геномами
Слайд 35Вірусні модифікації
Неспадкова мінливість вірусів пов’язана із змінами його оболонки
Фенотипове змішування виникає
внаслідок одночасної репродукції двох різних вірусів в клітині і зумовлене вбудовуванням компонентів оболонки одного вірусу в оболонку іншого
Фенотипове маскування може відбуватись при одночасному морфогенезі двох різних вірусів в інфікованій клітині, коли геном одного вірусу потрапляє в оболонку іншого
Слайд 36Негенетичні види взаємодії вірусів
Комплементація – функціональна кооперативна взаємодія вірусів з дефектами
у різних генах, при якій функцію ушкодженого гену одного вірусу бере на себе неушкоджений ген іншого
Таким чином, це уможливлює репродукцію обох вірусів, при неможливості розмножуватись окремо
Види комплементації:
Двостороння (обидва віруси дефектні)
Одностороння (тільки один вірус має ушкоджений геном)
Слайд 37Негенетичні види взаємодії вірусів
Інтерференція – неможливість проникнення і розмноження вірусів у
клітині, яка вже інфікована іншим вірусом
Види інтерференції:
Гомологічна
Гетерологічна
Слайд 38Механізми інтерференції
Інфікована клітина вивільняє інтерферон, який стимулює синтез рибонуклеази і протеінази,
що унеможливлює подальшу репродукцію вірусу
На інфікованій клітині блокуються або руйнуються рецептори, до яких може приєднатись інший вірус
Інактивація білків, які зв’язуються з геномом вірусу (блок трансляції)
Блокування утворення мРНК
Більш швидка реплікація одного вірусу викликає блокаду клітинних ферментів, необхідних для реплікації іншого
Слайд 39Практичне застосування молекулярної генетики бактерій
Вивчення організації геномів і створення хромосомних карт
бактерій, що є основою філогенетич-ної класифікації мікроорганізмів
Отримання рекомбінантних молекул ДНК з метою створення клітин із необхідними властивостями
Клонування рекомбінантних ДНК у векторних системах (плазмідах, вірусах
Слайд 40Практичне застосування молекулярної генетики бактерій
4. Визначення генетичних кодів для певних білків
за допомогою секвенування ДНК
5. Створення високо специфічних ДНК і РНК-зондів для виявлення нуклеїнових кислот збудника у матеріалі шляхом гібридизації з міченими зондами (southern-blot і northern-blot)
6. Діагностика інфекційних захворювань за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яка дозволяє підвищити кількість копій досліджуваної ДНК у 106-108 разів, і , відповідно, підвищити інформативність методів молекулярно-генетичної діагностики
Слайд 41Генна інженерія
Генна інженерія – сукупність експериментальних методів перенесення генетичного матеріалу з
однієї клітини в іншу з метою конструювання молекул ДНК з заданою комбінацією генів і створення біологічних об'єктів з корисними властивостями
Слайд 42Етапи генно-інженерних досліджень
Вибір і вилучення із організму клітин-донорів, що мають корисні
властивості, генетичного матеріалу.
2. Фрагментація отриманої ДНК з метою одержання окремих комбінацій генів
Слайд 43Етапи генно-інженерних досліджень
3. Введення отриманих фрагментів у вектори (плазміди або бактеріофаги)
4. Введення векторів з рекомбінантною ДНК в клітини мікроорганізмів (трансформація або трансфекція)
Слайд 44Етапи генно-інженерних досліджень
5. Аналіз мікробної популяції і виділення штаму рекомбінанта
6. Експлуатація одержаного штаму
продуцента:
- мікробіологічний синтез корисних речовин;
- клонуванння рекомбінантних генів для їх наступного закріплення у обраному геномі
Слайд 45Біотехнологія
Біотехнологія- наука, яка вивчає промислові процеси, в яких використовують мікроорганізми, біокаталізатори
і різні біологічні системи з метою отримання корисних для людей кінцевих продуктів
Слайд 46Етапи біотехнологічного процесу
Вибір природного штаму мікроорганізму-продуценту або штучне його створення
Вирощування штаму-продуценту
і біосинтез необхідного продукту
Виділення і очищення необхідної речовини із культурального середовища або клітинної маси
Стадія контролю готової продукції
Стадія отримання готової продукції
Слайд 47Лікарські препарати - продукти мікробного синтезу
Амінокислоти: лізин, триптофан, глютамінова кислота та
ін.
Вітаміни: групи В (В1, В2, В6, В9,В12), аскорбінова кислота
Антибіотики : пеніциліни, цефалоспорини, аміноглікозиди, макроліди, тетрацикліни та ін.
Людські гормони: інсулін, еритропоетин, соматотропний гормон
Слайд 48Лікарські препарати - продукти мікробного синтезу
5. Бактеріальні ферменти: L-аспаргіназа; стрептокіназа і
целіаза; солізим і сомілаза; терилітин і аспераза
6. Інтерферони: реальдирен, роферон, реаферон (α), бетафор,ребіф (β); імукін (γ)
7. Інтерлейкіни: ронколейкін; філграстим (нейпоген); ленограстим (граноцит 34);
молграмостим (лейкомакс)
Слайд 49Лікарські препарати - продукти мікробного синтезу
8. Антигени мікроорганізмів і вірусів :
антигени ВІЛ, вірусу гепатиту В
9. Вакцинні препарати: рекомбінантні і векторні вакцини, ДНК-вакцини, трансгенні рослинні вакцини