Слайд 2Классификация бактерий по источнику углерода
Автотрофы (лат. autos – сам, trophe –
питание) -
синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО2
Гетеротрофы (лат. heteros – другой) -
используют готовые органические углеродсодержащие соединения: гексозы (глюкоза), многоатомные спирты, углеводороды, органические кислоты, аминокислоты и др.: из окружающей среды – сапрофиты
живой клетки – паразиты:
облигатные = только живой клетки:
риккетсии
хламидии
факультативные = наряду с органическими соединениями окружающей среды – (большинствово патогенных бактерий)
Слайд 3Классификация бактерий по источнику энергии
Фототрофы (фотосинтезирующие) -
используют солнечную энергию,
например: зеленые
или пурпурные бактерии
Хемотрофы (хемосинтезирующие) -
получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций,
например: серобактерии, железобактерии, нитрифицирующие бактерии и др.
Слайд 4Классификация бактерий по природе донора электронов
Литотрофы (греч. litos – камень) -
хемотрофные
организмы, которые используют неорганические соединения: Н2, H2S, СН3 и др.
Органотрофы - хемотрофные организмы, которые используют органические соединения: сахара, оксикислоты, многоатомные спирты
Слайд 5Классификация бактерий по источнику азота
Прототрофы - усваивают азот из атмосферы, солей
аммония, нитратов, нитритов, глюкозы; способны сами синтезировать все компоненты клетки
Ауксотрофы - усваивают готовые азотсодержащие вещества из окружающей среды или организма хозяина;
-теряют способность к синтезу какого-либо в-ва и требуют его наличия в среде культивирования
В-во наз-ся фактор роста
Слайд 7Пути проникновения питательных веществ в бактериальную клетку
Без затраты энергии (диффузия)
простая
облегченная
С затратой
энергии
активный транспорт = без химической модификации переносимых молекул
транслокация химических групп = с химической модификацией переносимых молекул
п
е
р
м
е
а
з
ы
Слайд 8Дыхание бактерий
или энергетический обмен веществ = цепь последовательных окислительно-восстановительных реакций, сопровождающихся
переносом электронов от окисляющей системы к восстанавливающей и катализируемых строго специфичными ферментными системами.
Слайд 9Классификация бактерий по типу дыхания
1. Облигатные аэробы
2. Облигатные анаэробы
3. Факультативные
анаэробы
Среди них выделяют:
А) Микроаэрофилы
Б) Капнеические
Слайд 10Облигатные аэробы
Не развиваются без доступа кислорода,
Используют энергию, освобождающуюся при реакциях
окисления, протекающих с поглощением свободного молекулярного кислорода.
Растут на поверхности питательных сред.
Например: холерный вибрион, возбудители сибирской язвы и туберкулеза
Слайд 11Облигатные анаэробы
Кислород для них – яд!
Они осуществляют ферментативное расщепление углеводов в
анаэробных условиях – брожение.
Растут на дне или в толще плотной питательной среды.
Например: клостридии столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции
Слайд 12Факультативные анаэробы
растут как при доступе кислорода, так и при его отсутствии.
Используют энергию как от окислительных реакций, так и от брожения.
Например: эшерихии, сальмонеллы, стафилококки
Среди них выделяют:
А) Микроаэрофилы - хорошо растут при пониженном содержании кислорода.
Например: молочнокислые бактерии
Б) Капнеические - требуют повышенной концентрации СО2.
Например: бычий тип бруцелл, бифидумбактерии
Слайд 13Особенности метаболизма риккетсий, хламидий, микоплазм
Риккетсии
Не способны синтезировать некоторые макромолекулы → облигатный
внутриклеточный паразитизм
Хламидии
Не способны синтезировать некоторые макромолекулы → облигатный внутриклеточный паразитизм
Не способны синтезировать АТФ – «энергетические паразиты»
Микоплазмы
Не способны синтезировать стерины для ЦПМ – «мембранные паразиты»
Слайд 14Ферменты микроорганизмов
белки, участвующие в метаболизме бактерий,
распознают соответствующие им метаболиты, вступают
с ними во взаимодействие и ускоряют течение химических реакций
Слайд 15Классификация бактериальных ферментов по механизму действия
1. Оксидоредуктазы (оксидазы, пероксидазы, каталазы, дегидрогеназы)
– окислительно-восстановительные ферменты
2. Трансферазы – переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим
3. Гидролазы (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы) – ускоряют реакции гидролиза = расщепление веществ на более простые с присоединением молекулы воды
Слайд 16Классификация бактериальных ферментов по механизму действия
4. Лиазы (карбоксилазы) – отщепляют от
субстратов химические группы негидролитическим путем
5. Изомеразы (фосфогексоизомераза) – превращают органические соединения в их изомеры
6. Лигазы = синтетазы (аспарагинсинтетаза, глутаминсинтетаза) – ускоряют синтез сложных соединений из простых
Слайд 17Классификация бактериальных ферментов
Экзоферменты
Синтезируются во внешнюю среду
Эндоферменты
Локализация:
Периплазматическое пространство
ЦПМ
Цитоплазма
Слайд 18Классификация бактериальных ферментов
Конститутивные
Синтезируются постоянно (в том числе и при отсутствии
субстрата)
Индуцибельные
Синтезируются только при наличии субстрата
Например: пенициллиназа – синтезируется только при наличии пенициллина
Слайд 19Классификация бактериальных ферментов
Ферменты вирулентности (патогенности) – разрушают ткань и клетки, обусловливая
распространение бактерий и их токсинов в инфицированной ткани:
коллагеназа,
ДНКаза,
нейраминидаза,
лецитиназа
Слайд 21Рост – координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее к
увеличению массы клетки,
- согласованное увеличение количества всех компонентов клетки.
Размножение – увеличение числа клеток в популяции
Слайд 22Способы размножения бактерий
Бинарное деление
Большинство бактерий:
перегородка формируется от КС к центру клетки
– Г+
перетяжка клетки (клетка истончается посередине) – Г–
Почкование
Francisella
Микоплазмы
дрожжи
Фрагментация нитевидных форм
Актиномицеты
Микоплазмы
Экзоспоры
Стрептомицеты
Особый цикл деления
Хламидии
Слайд 25
Стадии развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде
Слайд 26Стадии роста периодической бактериальной культуры
Лаг-фаза
Деления клеток не происходит
Слайд 27Стадии роста периодической бактериальной культуры
Положительного ускорения
Скорость деления клеток увеличивается
Слайд 28Стадии роста периодической бактериальной культуры
Логарифмического роста (экспоненциальная)
Скорость деления клеток максимальная
Слайд 29Стадии роста периодической бактериальной культуры
Отрицательного ускорения
Скорость деления клеток снижается
Слайд 30Стадии роста периодической бактериальной культуры
Стационарная фаза максимума
Количество живых клеток постоянно
Слайд 31Стадии роста периодической бактериальной культуры
Ускоренной гибели
Количество живых клеток начинает снижаться
(убывает с увеличивающейся скоростью)
Слайд 32Стадии роста периодической бактериальной культуры
Логарифмической гибели
Количество живых клеток убывает с
максимальной скоростью
Слайд 33Стадии роста периодической бактериальной культуры
Уменьшения скорости гибели
Количество живых клеток убывает
с уменьшающейся скоростью
Слайд 34Стадии роста периодической бактериальной культуры
Стационарная фаза минимума
Количество живых клеток минимально
Слайд 35Характер роста бактерий на жидких питательных средах
Диффузный рост = помутнение –
большинство бактерий,
плёнка – «коховские бактерии» ,
придонный или пристеночный рост – стрептококки,
плёнка со спускающимися вниз «сталактитами» – Yersinia pestis
Слайд 36Характер роста бактерий на плотных питательных средах
Слайд 37Характер роста бактерий на плотных питательных средах
S-форма колоний («гладкая»)
кокки
Грамотрицательные палочки, кроме
Yersinia pestis
R-форма колоний («шероховатая»)
Грамположительные палочки,
Yersinia pestis
Слайд 38
Некультивируемые формы бактерий
В неблагоприятных условиях (в межэпидемический или межэпизоотический периоды) неспорообразующие
бактерии переходят в некультивируемое состояние:
бактерии сохраняют метаболическую активность, но не способны к клеточному делению,
- клетки уменьшаются в размерах,
- приобретают сферическую форму,
- меняют вязкость ЦПМ,
- у них сохраняется транспорт электронов по дыхательной цепи,
- невысокий уровень метаболической активности.
Слайд 39
Некультивируемые формы бактерий
Факторы:
- температура,
- концентрация солей,
- уровень кислорода,
- содержание
питательных веществ,
- метаболиты водорослей.
При смене условий→ клетки приобретают способность к размножению и восстанавливают свои свойства.
Слайд 40ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ
Слайд 42Требования к условиям культивирования бактерий
1.Питательные потребности
простые – растут на универсальных питательных
средах
сложные – растут на специальных питательных средах
2.Температура культивирования
≈ 37°С – мезофилы (бол-во патогенных бактерий)
6 – 20°С – психрофилы (возбудители чумы и лептоспироза),
50 – 60°С – термофилы (актиномицеты, спороносные бациллы).
Слайд 43Требования к условиям культивирования бактерий
3. Реакция среды (рН)
кислая – ацидофилы (рН
= 4,0-6,0)
нейтральная – большинство патогенных бактерий
щелочная – алкалифилы ( для холерного вибриона рН = 7,8-8,6)
4.Условия аэрации
не принимают во внимание – факультативные анаэробы
↓ О2 – микроаэрофилы
↑ СО2 – капнофилы
без доступа воздуха – анаэробы
с обязательным доступом воздуха – облигатные аэробы
Слайд 44Требования к условиям культивирования бактерий
5. Длительность культивирования - зависит от времени
генерации,
- для большинства бактерий составляет 24-48 ч;
некоторые растут дольше:
- бактерии коклюша – 2-5 сут,
- микробактерии туберкулеза – 3-4 нед.
6. Освещение - например, микобактерии.
Слайд 45Питательные среды
А) должны содержать воду, т к все процессы осуществляются в
воде
Б) должны содержать органический источник углерода и энергии:
- органические соединения: углеводы (Глюкоза!) аминокислоты, органические кислоты, липиды,
- пептон- продукт неполного гидролиза белков, состоит из поли-, олиго- дипептидов,
Слайд 46Питательные среды
В) должна содержать:
- источники азота – пептон и соли
аммония,
- серы - сульфаты,
- фосфора - фосфаты,
- микроэлементы = ионы кальция, магния, магранца, железа – соли (фосфаты)
Г) должна обладать буферными свойствами = фосфатный буфер или фосфатный буфер + карбонат кальция
Д) должна быть изотонической – 0,87% хлорид натрия
Слайд 47Классификация искусственных
питательных сред
По происхождению:
Естественные – натуральные продукты животного, растительного
или микробного происхождения (молоко, сыворотка, кровь, картофель, морковь),
Синтетические – химически чистые соединения в строго определенных концентрациях = минимальные среды (основа: минеральные соли и глюкоза),
Полусинтетические – минимальные среды, к которым добавлен пептон и дрожжевой экстракт
Слайд 48Классификация искусственных
питательных сред
По сложности изготовления:
Простые – выпускаются промышленностью
в сухом виде;
основу их составляют пептоны – продукты ферментативного или кислотного гидролиза белков животных и рыбы (питательный бульон, питательный агар),
Сложные - готовятся на основе простых: добавляют 1% сахара, 10-20% сыворотки крови или 5-10% крови (кровяной агар, сахарно-сывороточный агар)
Слайд 49Классификация искусственных
питательных сред
По консистенции
Жидкие – мясной или рыбный бульон
на дистиллированной воде (Питательный бульон),
Плотные – готовятся на основе жидких, добавляют 1,5% агар-агара (полисахарид, получ-й из морских водорослей), силикагеля или 10-15% желатины (Питательный агар)
Полужидкие – готовят на основе жидких, но агар-агара или силикагеля добавляют 0,7%, а желатины – 5-7,5%
Слайд 50Классификация искусственных
питательных сред
По назначению
Консервирующие – применяются для предотвращения отмирания бактерий
в патологическом материале (Глицериново-солевая смесь),
Основные – применяются для культивирования большинства бактерий (Питательные бульон и агар),
Элективные – обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного вида бактерий (Желточно-солевой бульон для стафилококка, желчный бульон для сальмонелл),
Дифференциально-диагностические – применяются для изучения биохимических свойств при идентификации бактерий (Среды Гисса, Ресселя, Эндо)
Слайд 52
Методы выделения чистых культур аэробов
Слайд 53Методы выделения чистых культур аэробов
1. Механическое разобщение клеток:
а) метод Коха: готовят
десятикратные разведения материала в хлориде натрия, из каждого разведения 1 петлю вносят в пробирку с агаром (400) и выливают его в чашку Петри;
б) метод Дригальского: 1 петлю материала наносят на поверхность агара в чашку Петри и растирают шпателем, затем, не прожигая его, растирают по поверхности агара второй, а затем третьей чашки и т.д;
Слайд 54Методы выделения чистых культур аэробов
1. Механическое разобщение клеток:
в) механическое разобщение петлей;
г)
количественный метод Голда: 1 мл жидкого или 1 г твердого материала вносят в 9 мл NaCl, затем 1 петлю материала наносят на чашку = делают 40 штрихов (сектор А), задевая штрихи сектора А, проводят 4 штриха (1-й сектор), аналогично засевают 2-й и 3-й секторы
Слайд 56Методы выделения чистых культур аэробов
2. Предварительная обработка материала с помощью физических
или химических факторов.
Например: 1) неспорообразующие бактерии уничтожают прогреванием при 80 0С 20 мин, споры при этом сохраняются;
2) для выделения микобактерий материал обрабатывают кислотой, при этом сопутствующая флора погибает
Слайд 57Методы выделения чистых культур аэробов
3. Избирательное подавление сопутствующих бактерий физическими или
химическими факторами во время инкубации посевов.
Например: для выделений иерсиний чумы посевы инкубируют при Т=5 0
4. Заражение чувствительных животных = для выделения возбудителя чумы из трупов грызунов
5. Использование биологических свойств бактерий. Например: метод Шукевича для выделения протея (ползучий рост).
Слайд 58Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий
Слайд 59Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий
Физические
Химические
Биологические
Метод Китта-Тароцци
Слайд 60Физические методы
1.культивирование в анаэростате (выкачивается воздух) или аппарате Киппа (замещается инертным
газом, например азотом)
2. использование трубки Виньяла-Вейона (смешивание м/о с расплавленной и охлаждённой питательной средой с её последующим застыванием – глубинное культивирование)
3. посев уколом в высокий столбик (полужидкой среды)
Слайд 61Физические методы
4. культивирование под слоем масла
5. регенерация жидкой питательной среды перед
засевом (кипячение с последующим быстрым охлаждением)
Слайд 62Химические методы
А. Добавление в среду культивирования химических веществ = поглотителей кислорода,
в
замкнутом объёме протекает химическая реакция с поглощением кислорода
2 метода:
метод Аристовского (сыпучие ингредиенты)
метод Омелянского (жидкие ингредиенты),
Б. включение в питательную среду редуцирующих веществ (связывают растворённый в среде кислород)
глюкоза
тиогликолевая кислота и др.
Слайд 63Биологические
метод Фортнера (в замкнутом объёме культивируются анаэробы и жадный аэроб –
после прекращения роста которого в безкислородной среде начинают расти анаэробы)
Слайд 64Метод Китта-Тароцци
среда Китта-Тароцци
МПБ с глюкозой
на поверхности – масло (механическая защита)
на дне
– кусочки печени (для поглощения кислорода)
Слайд 65Этапы бактериологического исследования
1. Забор материала
2. Транспортировка
3. Посев на плотные питательные среды
для получения изолированных колоний.
4. Выделение чистой культуры
5. Идентификация
Слайд 66
1. Забор материала
а) выбор материала определяется клинической картиной:
- при заболеваниях
верхних дыхательных путей – слизь из носа и зева, мокрота;
- при заболеваниях желудочно-кишечного тракта – испражнения, промывные воды, рвотные массы;
- при генерализованных формах – кровь;
б) материал берут до начала лечения – антибиотики затрудняют выделение;
в) в разные стадии заболевания берут разный материал- н-р, брюшной тиф
г) материал берут асептически в стерильную посуду
Слайд 67
2.Транспортировка
а) необходимы специальные транспортные среды,
б) важно соблюдать условия транспортировки:
температура,
влажность,
время.
Слайд 68
3. Посев материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
Колония – видимое скопление микроорганизмов, выросшее из одной бактериальной клетки на плотной питательной среде
Изолированная колония – не соприкасается краями с другими колониями
Слайд 70
4.Выделение чистой культуры и накопление биомассы:
4.1 . Изучение культуральных признаков
4.2.
Изучение морфологических и тинкториальных (отношение к окраске) признаков = приготовление мазка и окраска по Граму
4.3. Посев на скошенный столбик элективной питательной среды
4.4. Проверка чистоты культуры = мазок, окраска по Граму
Слайд 71
Культуральные признаки бактерий
– это характер колоний на плотной питательной среде
Слайд 725. Идентификация выделенной чистой культуры
Это изучение биохимических и серологических свойств бактерий:
А)
Определение сахаролитических ферментов
Б) Определение протеолитических ферментов
Слайд 73Определение сахаролитических ферментов
= посев на «пестрый ряд» (среды Гисса – включают
в себя углевод и индикатор Андреде).
Для сбора газообразных продуктов в пробирки помещают поплавок.
Различают:
- Короткий «пестрый ряд» включает углеводы: глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит
- Длинный «пестрый ряд» включает те же углеводы, что и короткий ряд: глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит и дополнительно в его состав входят:
1) моносахариды: арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза;
2) полисахариды: инулин, крахмал, гликоген;
3) спирты: глицерин, дульцит, инозит
Слайд 74Определение сахаролитических ферментов
Принцип действия:
утилизация содержащегося в среде углевода с образованием
кислоты
⇓
сдвиг рН в кислую сторону
⇓
изменение цвета среды
Разложение кислоты на газ и воду
⇓
Газ собирается в поплавке
Слайд 75Определение сахаролитических ферментов
I. Среды Гисса = 'пестрый ряд':
а - жидкая
среда с углеводами и индикатором Андреде;
б - полужидкая среда с индикатором ВР:
1 - микроорганизмы не ферментируют углевод;
2 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты;
3 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты и газа;
II. - колонии микроорганизмов, не разлагающих (бесцветные) и разлагающих лактозу (фиолетовые на среде ЭМС - слева, красные на среде Эндо - справа)
Слайд 76Определение сахаролитических ферментов
Учет результатов:
Если цвет среды изменился, бактерии ферментируют этот углевод
до кислых продуктов (ставят в таблице букву К).
2. Если наряду с изменением цвета среды в поплавке обнаруживается газ, бактерии ферментируют этот углевод до кислоты и газа (ставят – КГ).
3. Если цвет среды не изменился, бактерии не ферментируют этот углевод
Слайд 77Определение протеолитических ферментов
= посев бактерий уколом в столбик 10-20% желатины и
пептонную воду (в пробирку к пробке прикрепляют индикаторные бумажки:
- 1. на индол = С8Н7N – Способ Эрлиха: в пробирку с культурой добавляют 2-3 мл эфира и реактив Эрлиха (спиртовый раствор пара-диметил-амино-бенз-альдегид с хлористоводородной кислотой →встряхивают → розовое окрашивание
или + горячий насыщенный раствор щавелевой кислоты → красное),
Слайд 79Определение протеолитических ферментов
- 2. сероводород – Н2S – бумажка, смоченная сульфатом
железа → при выделении Н2S образуется нерастворимый сульфит железа → черная окраска
- или в пробирку с питательной средой добавляют смесь солей (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия) и уколом засевают истыпуемый штамм → по ходу укола черное окрашивание,
- 3. аммиак=N Н3 – лакмусовая бумажка.
Слайд 80Определение протеолитических ферментов
Учет результатов:
1. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин,
образуя «воронку» или «елочку».
2. При образовании газообразных продуктов разложения пептона бумажки меняют цвет:
бумажка на аммиак – синеет,
бумажка на сероводород - чернеет,
бумажка на индол – розовеет.
Слайд 81Протеолитические свойства микроорганизмов.
1 - формы разжижения желатина;
II - определение сероводорода;
III - определение индола:
1 - отрицательный результат;
2 - положительный результат
Слайд 82Пестрый ряд для кишечной палочки
Слайд 83Определение наличия отдельных ферментов
Для обнаружения каталазы на стекло наносят культуру и
каплю
1-3% р-ра Н2О2 → пузырьки газа.
Слайд 84Определение наличия отдельных ферментов
оксидазная активность = покраснение индикаторной бумажки
Слайд 85Определение гемолитической активности
Слайд 86Ускоренные методы биохимической идентификации
СИБ = системы индикаторных бумажек = набор
дисков, пропитанных субстратами, их вносят в пробирки или на чашки с чистой культурой.
набор мультимикротестов =пластиковые планшеты, в лунки которых помещены субстраты с индикаторами → в лунки вносят бактерии, инкубируют 4 часа при 37о → учитывают результаты