Ферментативные свойства микроорганизмов презентация

веществ в бактериальную клетку:
- пассивный;
- активный.
При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по градиенту концентрации. Затрат энергии при этом не происходит.
Различают две разновидности пассивного переноса:
- простая диффузия (неспецифическое проникновение веществ в клетку, при этом решающее значение имеет величина молекул и липофильность. Скорость переноса незначительна);
- облегченная диффузия (осуществляется за счет особенных белков - пермеаз, которые содержатся в цитоплазматической мембране. Этот процесс также не требует энергетического обеспечения. Скорость этого переноса зависит от концентрации вещества в наружном слое).

переносить только определенные субстраты. Этот процесс происходит за счет энергии, которую генерирует клетка, потому возможен перенос против градиента концентрации.

Два типа активного транспорта:
1. Небольшие молекулы (аминокислоты, некоторые сахара) «накачиваются» в клетку в концентрации в 100—1000 раз выше, чем снаружи клетки.
2. Транслокация радикалов - включение в клетку некоторых сахаров (например, глюкозы, фруктозы), которые в процессе переноса фосфорилируются, т. е. химически модифицируются с помощью специальной фосфотрансферной системы, составной частью которой является белок-переносчик.

Выделяют также механизм ионного транспорта, при котором происходит перенос в клетку отдельных неорганических ионов.

и др. полимеров) из соответствующих низкомолекулярных соединений. Процесс, противоположный катаболизму. Необходимая для А. энергия (главным образом в форме АТФ) поставляется либо за счет реакций окисления органических или неорганических соединений (дыхание, брожение), либо за счет конверсии света (фотосинтез).

Катаболизм (диссимиляция) – совокупность реакций метаболизма, 
приводящих к расщеплению сложных органических веществ. Сопровождается синтезом АТФ (по этой причине под К. понимают обычно энергетический обмен клетки), низкомолекулярных соединений, которые используются клеткой в биосинтезе (анаболизме).

Амфиболизм: все реакции промежуточного обмена клетки. К амфиболизму относятся процесс образования в ходе катаболизма мономеров при разрушении (деградации) сложных субстратов.

перенос функциональных групп на молекулу воды

ЛИАЗЫ – присоединение групп по двойным связям и обратные реакции

ИЗОМЕРАЗЫ – перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм

ЛИГАЗЫ (синтетазы) – образование связей С-С, С-S, C-O, C-N за счет реакций конденсации с распадом АТФ.

клеточной мембраной; или выделяющихся во внешнюю среду. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз являются экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа, являются ферментами агрессии.

Эндоферменты прочно связаны с протоплазмой клетки и действуют только внутриклеточно, осуществляя дальнейшее разложение поступающих питательных веществ и превращение их в составные части клетки (например, дегидрогеназы, оксидазы).

Пермеазы: белки–переносчики, участвующие в активном транспорте веществ через цитоплазматическую мембрану. Обладают специфичностью к переносимым соединениям. Перенос веществ П. осуществляется против градиента их концентраций и зависит от АТФ или др. носителей метаболической энергии. Кишечная палочка содержит 30—60 различных П.

на конститутивные и индуцибельные.
Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от того, на какой среде бактерия выращивается.
Например, ферменты гликолиза (катализируют распад глюкозы).

Индуцибельные ферменты продуцируются бактерией лишь в ответ на действие специфического индуктора, присутствующего в среде.
Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов, например, 5-галактозидаза - катализирует гидролитическое расщепление лактозы на составляющие моносахариды.

% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 N растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводов. Среда при рН 7,2—7,4 бесцветна. При разложении углеводов она приобретает красный цвет.
Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда". Короткий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.).
Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.
Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом".

образованием кислоты и газа глюкозу (1), маннит (2) и лактозу (3), а также не разлагает мочевину. Ферментация углеводов с образованием кислоты приводит к покраснению среды (в среду добавлен индикатор нейтральный красный); газообразование проявляется появлением пузырей газа в поплавках. При гидролизе мочевины (6) происходит защелачивание среды за счет образование аммиака и ее посинение (в пробирку добавлен индикатор бромтимоловый синий).

средами (питательная основа + субстрат + индикатор) и высушенные, хранятся во флаконах. В лаборатории диски раскладываются в стерильные пробирки и заливаются густой суспензией исследуемой культуры в физрастворе. Учет проводят после 18-24 часовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора.

3. Панели биохимической идентификации.
Принцип действия: в лунках специальных пластиковых панелей находятся высушенные питательные среды (питательная основа + субстрат + индикатор). В лунки вносят суспензию испытуемой культуры и после инкубации (от 5 до 24 часов) учитывают результат по изменению цвета индикатора.
Примеры: Панель биохимической дифференцировки энтеробактерий - ПБДЭ (Россия); АР1-20Е (Франция);Crystal (США).

4. Системы автоматизированной идентификации.
Принцип действия тот же, что и в предыдущем пункте, однако инкубация панелей, учет результатов и идентификация проводятся при помощи компьютера.
Примеры: МЗ-2 (США); BIOSCREEN (Финляндия); SEPTOR (США)

(расщепление белка и образование индола, сероводорода, мочевины и аммиака)
Окислительно-восстановительные.


Протеолитические ферменты микробов – протеазы, катализирующие расщепление белка. Для их выявления исследуемую культуру засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок (желатин, свернутая лошадиная сыворотка, коагулированный яичный белок, молоко и т.д.). При наличии протеолитических свойств питательная среда разжижается.

белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, мочевины и аммиака.

Определение индола: индол образуется при расщеплении триптофана. После посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды (прижимают пробкой); посев инкубируют 24-48 часов при температуре 37 град. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет.

Определение сероводорода (конечный продукт расщепления аминокислот, содержащих серу – цистина, цистеина и метионина). Петлю исследуемой культуры засевают в пробирку с МПБ. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги. Образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

бромтимоловым синим. При наличии гидролиза происходит защелачивание среды за счет образование аммиака, индикатор приобретает синий цвет.
Образование аммиака. Для определения способности к образованию аммиака проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Окислительно-восстановительные ферменты (связаны главным образом с дыхательной функцией микроорганизма): тесты на каталазу и цитохромоксидазу, редуцирующую способность.

Деревянной палочкой (зубочисткой) снимают с агара колонию и опускают в реактив. При положительном результате появятся пузырьки газа.

Каталаза— фермент, который катализирует разложение образующегося в процессе биологического окисления токсичного пероксида водорода на воду и молекулярный кислород.

помощью электронов цитохрома-с и транспорт протонов сквозь клеточную мембрану. Энергия, полученная в этом процессе, используется для создания трансмембранного протонного градиента
На чашку Петри с выросшей культурой наливают 1% раствор тетраметил-парафенилендиамина гидрохлорида. Культура, обладающая оксидазой, окрашивается в пурпурно-красный цвет.

Тест на редуцирующую способность бактерий (в метиленовом молоке) основан на следующей особенности: при окислительно-восстановительных реакциях у бактерий акцептором водорода может быть кроме молекулярного кислорода ряд органических красителей, которые, присоединяя водород, восстанавливаются и обесцвечиваются (в анаэробных условиях). Такие свойства отмечены у лакмусовой настойки, метиленового синего, малахитового зеленого и т. д. Например, в готовом виде молоко с метиленовым синим голубого цвета. Через сутки инкубирования посевов в случае редукции красителя среда окрашивается в кремовый цвет.