повторов (синдром Мартина-Белл, атаксия Фридрейха).
Методы молекулярно-генетической диагностики.
- Главная
- Разное
- Дизайн
- Бизнес и предпринимательство
- Аналитика
- Образование
- Развлечения
- Красота и здоровье
- Финансы
- Государство
- Путешествия
- Спорт
- Недвижимость
- Армия
- Графика
- Культурология
- Еда и кулинария
- Лингвистика
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Маркетинг
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Болезни экспансии некодирующих повторов (синдром Мартина-Белл, атаксия Фридрейха). Методы молекулярно-генетической диагностики презентация
Содержание
- 1. Болезни экспансии некодирующих повторов (синдром Мартина-Белл, атаксия Фридрейха). Методы молекулярно-генетической диагностики
- 2. Общие методы Выделение ДНК Полимеразная цепная реакция
- 3. Оборудование для ДНК-диагностики Амплификаторы Термостаты настольные для пробирок (от 25-95С) Центрифуга для микропробирок Трансилюминатор
- 4. Источники геномной ДНК Цельная кровь Культура
- 5. Электрофорез – метод разделения белков, нуклеиновых кислот
- 6. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
- 7. ПЦР Состав реакционной смеси: Исследуемый образец Буфер,
- 8. ПЦР Стадии ПЦР Денатурация Отжиг Элонгация
- 9. Денатурация Отжиг Полимеризация Tag-полимераза
- 11. Специфичность ПЦР
- 12. Аллель-специфичная ПЦР Один из праймеров коплементарен мутантному
- 14. Аллель-специфичная амплификация
- 15. Мультилокусная ПЦР ПЦР с несколькими парами праймеров,
- 16. Многолокусная ПЦР с флуоресцентно меченными праймерами
- 17. ПЦР-диагностика делеций в гене дистрофина при мышечной
- 18. ПДАФ Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов
- 19. Эндонуклеазы рестрикции Ферменты, узнающие определенные короткие (4-8
- 20. ПДРФ анализ ----------------CCGG-------норма
- 21. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
- 22. ДНК- диагностика аутосомно-рецессивного заболевания
- 23. КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ
- 24. ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q188R (исчезновение сайта рестрикции)
- 25. ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К285N (появление сайта рестрикции)
- 26. ДНК-диагностика Подтверждение диагноза Диагностика носительства Пресимптоматическая диагностика Пренатальная (дородовая) диагностика Предимплантационная диагностика
- 27. Прямая ДНК-диагностика Определение мутации, являющейся непосредственной причиной
- 28. ДНК-ДИАГНОСТИКА ПРЯМАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА Возможна только когда известна
- 29. Прямая ДНК-диагностика ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллель-специфическая
- 30. Методы поиска мутаций в генах
- 31. SSCP-анализ Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК Замена
- 32. Схема проведения SSCP анализа
- 33. Схема проведения анализа гетеродуплексов (НА)
- 34. Диагностика нейрофиброматоза 1 типа (определение мутаций гена
- 35. Гибридизация ДНК-ДНК - комплементарное взаимодействие между одноцепочечными
- 36. Прямое обнаружение мутации ΔF508 в ДНК девяти
- 37. FISH – флуоресцентная гибридизация in situ
- 38. Блотинг Саузерн-блотинг Рестрикция Разделение изучаемого фрагмента
- 41. Блоттинг-гибридизация
- 42. Секвенирование ДНК
- 43. Биочипы Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов
- 44. Косвенная ДНК-диагностика Основана на анализе сцепления Анализ
- 45. Полиморфные варианты ДНК Различия в последовательности ДНК
- 46. Вариабельность ДНК Около 99,7% ДНК-последовательности у всех
- 47. Повторяющиеся последовательности Сателлитная ДНК – размер повторяющегося
- 48. Анализ длин микросателлитных полиморфных повторов
- 49. Номенклатура ДНК-маркеров ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена
- 50. Выбор ДНК-маркеров Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах
- 51. Н М A1 A2 A3
- 52. ?
- 53. Пример 99 пн 96 пн 105пн 90пн ?
- 54. Пример 99 пн 96 пн 105пн 90пн ?
- 55. ДНК-диагностика по возможности использовать несколько подходов к
- 56. Болезни экспансии тринуклеотидных повторов Экспансия кодирующих тринуклеотидных
- 57. Синдром Мартина-Белл - Нормальное телосложение Широкий
- 59. Схема расположения фолатчувствительных ломких сайтов на Х-хромосоме
- 62. Проявлением синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы) является экспансия
- 63. ДНК-диагностика синдрома Мартина-Белл Блот-гибридизация по Саузерну
- 64. Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Мартина-Белл М
- 65. Multiplex PCR methylation test for FRAXA,FRAXE and
- 66. Метил- специфичная ПЦР
- 67. Определение количества CGG триплетов в гене FMR1, ограничение метода - 130 повторов CGG
- 68. М
- 69. Диагностика синдрома Мартина-Бепп 1
- 70. Диагностика синдрома Мартина-Белл Исследование кариотипа пробанда для
Общие методы Выделение ДНК Полимеразная цепная реакция Рестрикционный анализ Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле Блотинг по Саузерну
Слайд 1Семинар 5
Немцова М.В.
Медицинская генетика
Фармация Курс 3 ЦИОП «Медицина будущего»
Болезни экспансии некодирующих
Слайд 2Общие методы
Выделение ДНК
Полимеразная цепная реакция
Рестрикционный анализ
Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле
Блотинг
по Саузерну
Слайд 3Оборудование для ДНК-диагностики
Амплификаторы
Термостаты настольные для пробирок (от 25-95С)
Центрифуга для микропробирок
Трансилюминатор
Слайд 4Источники геномной ДНК
Цельная кровь
Культура клеток
Букальный эпителий
Пятна высушенной крови
Другие источники
Сыворотка,
плазма крови, образцы мочи, образцы тканей
При делециях мтДНК предпочтительный материал – образец мышечной ткани
Блоки фиксированной ткани
При делециях мтДНК предпочтительный материал – образец мышечной ткани
Блоки фиксированной ткани
Слайд 5Электрофорез – метод разделения белков, нуклеиновых кислот по размерам фрагментов или
частиц в акриламидном или агарозном геле под действием электрического тока.
Слайд 6
Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
Фрагменты ДНК
Буфер
Агарозный гель
Чем меньше фрагменты ДНК, тем
быстрее они передвигаются в геле
Слайд 7ПЦР
Состав реакционной смеси:
Исследуемый образец
Буфер, содержащий ионы магния
Смесь АТФ, ТТФ, ГТФ,СТФ
Taq-полимераза
Специфические олигонуклеотидные
праймеры
Слайд 12Аллель-специфичная ПЦР
Один из праймеров коплементарен мутантному аллелю, другой- нормальному. Обратный праймер
– общий для двух реакций
N M N M N M
1 2 3
Слайд 15Мультилокусная ПЦР
ПЦР с несколькими парами праймеров, соответствующих разным участкам гена
Пример –ДНК-диагностика
делеций при миодистрофии Дюшена
Слайд 17ПЦР-диагностика делеций в гене дистрофина при мышечной дистрофии Дюшена.
1-маркер мол.
веса; 2-6 и 7-11 – многолокусная ПЦР с набором праймеров для амплификации различных экзонов гена дистрофина: 2 – К-, 3 – К+, 4 – делеция 3-4 экзонов, 5 – делеция 43 экзона, 6 – делеции нет; 7 – К-, 8 – К+, 9 – делеция 6 экзона, 10 – делеция 19-32 экзонов, 11 – делеции нет.
Слайд 18ПДАФ
Полиморфизм длины амплифицированных
фрагментов
регистрация небольших
делеций и дупликаций
ДНК-диагностика мутации
ΔF508 при муковисцидозе
ДНК-диагностика заболеваний, связанных с экспрессией тринуклеотидных повторов
ДНК-диагностика заболеваний, связанных с экспрессией тринуклеотидных повторов
Слайд 19Эндонуклеазы рестрикции
Ферменты, узнающие определенные короткие (4-8 пн) последовательности в ДНК (сайты)
и разрезающие двухцепочечную ДНК
Пример: MspI (CCGG)
GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT
Пример: MspI (CCGG)
GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT
Слайд 20ПДРФ анализ
----------------CCGG-------норма режет
----------------CCGA-------мутация не режет
400
пн
300 пн
100 пн
MspI
MspI узнает
последовательность
’CCGG, соответствующую нормальному аллелю
400 пн
300 пн
100 пн
Слайд 23 КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ
Характеристика мутации
Описано более 160 различных мутаций
Мутации Q188R, K285N обуславливают тяжелый фенотип (самые частые мутации 70-80% аллелей)
N314D обуславливает, т.н. вариант Дуарте
S135L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка)
5’
экзоны: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Характеристика гена GALT
локализация гена 9p13
11 экзонов
Слайд 24 ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q188R
(исчезновение сайта рестрикции)
1. ПЦР экзонов 5-6 гена GALT
–
фрагмент размером 477 п.н.
2. Рестрикционный анализ с
использованием фермента
рестрикции Bst2UI (CC^WGG)
3. При мутации Q188R исчезает сайт
рестрикции для Bst2U I и
Появляется фрагмент размером
377 п.н.
4. На рисунке справа:
1 – Q188R в гетерозиготном
состоянии
2 – норма
3 - Q188R в гомозиготном состоянии
фрагмент размером 477 п.н.
2. Рестрикционный анализ с
использованием фермента
рестрикции Bst2UI (CC^WGG)
3. При мутации Q188R исчезает сайт
рестрикции для Bst2U I и
Появляется фрагмент размером
377 п.н.
4. На рисунке справа:
1 – Q188R в гетерозиготном
состоянии
2 – норма
3 - Q188R в гомозиготном состоянии
Слайд 25 ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К285N
(появление сайта рестрикции)
1. ПЦР экзона 9 гена GALT
–
фрагмент размером 160 п.н.
2. Рестрикционный анализ с
использованием фермента
рестрикции Sse9 I (^AATT)
3. При мутации K285N возникает сайт
рестрикции для Sse9 I и появляются
фрагменты размером 98 п.н.
и 62 п.н.
4. На рисунке справа:
1– Норма
2 – K285N в гетерозиготном состоянии
фрагмент размером 160 п.н.
2. Рестрикционный анализ с
использованием фермента
рестрикции Sse9 I (^AATT)
3. При мутации K285N возникает сайт
рестрикции для Sse9 I и появляются
фрагменты размером 98 п.н.
и 62 п.н.
4. На рисунке справа:
1– Норма
2 – K285N в гетерозиготном состоянии
160 п.н.
98 п.н.
62 п.н.
Слайд 26ДНК-диагностика
Подтверждение диагноза
Диагностика носительства
Пресимптоматическая диагностика
Пренатальная (дородовая) диагностика
Предимплантационная диагностика
Слайд 27Прямая ДНК-диагностика
Определение мутации, являющейся непосредственной
причиной заболевания
Косвенная ДНК-диагностика
Определение хромосомы, несущей поврежденный ген
при семейном анализе
Слайд 28ДНК-ДИАГНОСТИКА
ПРЯМАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА
Возможна только когда известна структура гена
Возможна и без больного члена
семьи
(анализ ДНК родителей пробанда)
Высокая точность
Возможна при полилокусном заболевании
(анализ ДНК родителей пробанда)
Высокая точность
Возможна при полилокусном заболевании
КОСВЕННАЯ
ДНК-ДИАГНОСТИ КА
Возможна когда известно положение гена, а мутация или последовательность неизвестны
обязательно проведение семейного анализа и анализ образца больного члена семьи
Точность зависит от расположения маркеров
Обязательно наличие одного локуса заболевания
Слайд 29Прямая ДНК-диагностика
ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллель-специфическая амплификация, ПДАФ)
ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ
полиморфизма длины рестрикционных фрагментов)
Секвенирование (определение последовательности) гена
Блотинг по Саузерну
Биочипы
Секвенирование (определение последовательности) гена
Блотинг по Саузерну
Биочипы
Слайд 30Методы поиска мутаций в генах
SSCP-анализ
Денатурирующий гель электрофорез или денатурирующая ВЭЖХ
Секвенирование
Биочипы
Блотинг по Саузерну (детекция крупных перестроек)
Биочипы
Блотинг по Саузерну (детекция крупных перестроек)
Слайд 31SSCP-анализ
Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК
Замена даже одного нуклеотида приводит к измененим
конформации цепей, что изменяет их электрофоретическую подвижность
Чувствительность 70-80%
Чувствительность 70-80%
Слайд 34Диагностика нейрофиброматоза 1 типа (определение мутаций гена NF1 методом SSCP)
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
экзон 2
экзон 42
экзон 8
экзон 26
экзон 40
экзон 13
Слайд 35Гибридизация ДНК-ДНК - комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников
(ДНК-зонд и
ДНК-мишень)
Слайд 36Прямое обнаружение мутации ΔF508 в ДНК девяти детей с CF. ДНК
амплифицируют с помощью ПЦР и помещают на мембрану в двух экземплярах. Мембрану гибридизуют с одним из двух специфичных олигонуклеотидных зондов. Нуклеотиды первого зонда (олиго-N) комплементарны к нормальной последовательности; последовательность второго зонда является комплементарной к ДНК с делецией ΔF508. ДНК из индивидуумов, гомозиготных по мутации гибридизуется только со вторым зондом, ДНК индивидуумов гетерозиготных по мутации гибридизуется с двумя олигонуклеотидами, и ДНК от лиц, гомозиготных по нормальной последовательности гибридизуется только с первым зондом.
Слайд 38Блотинг
Саузерн-блотинг
Рестрикция
Разделение изучаемого фрагмента в геле
Денатурация
Перенос на мембрану
Гибридизация с меченной
пробой
Слайд 43Биочипы
Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов
Олигонуклеотиды специфично
гибридизуются с меченными молекулами ДНК
Слайд 44Косвенная ДНК-диагностика
Основана на анализе сцепления
Анализ полиморфных маркеров ДНК
1
2
3
4
1
1
2
3
3
4
Слайд 45Полиморфные варианты ДНК
Различия в последовательности ДНК (Однонуклеотидные полиморфизмы – SNP)
-----------AGGCTG-------------
-----------AAGCTG-------------
Различия
в длине последовательностей
----------AATG AATG----------------
----------AATG AATG AATG-------
----------AATG AATG----------------
----------AATG AATG AATG-------
Слайд 46Вариабельность ДНК
Около 99,7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны
Около 0,3% (примерно 10
000 000 нуклеотидов) различаются между отдельными индивидами.
Слайд 47Повторяющиеся последовательности
Сателлитная ДНК – размер повторяющегося элемента от нескольких сотен до
нескольких тысяч пн
Минисательтная ДНК (VNTR – variant number tandem repeats) размер повторяющегося элемента 10-100пн
Микросательтная ДНК (STR – short tandem repeats) размер повторяющегося элемента 2-6 пн
Минисательтная ДНК (VNTR – variant number tandem repeats) размер повторяющегося элемента 10-100пн
Микросательтная ДНК (STR – short tandem repeats) размер повторяющегося элемента 2-6 пн
Слайд 49Номенклатура ДНК-маркеров
ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена обозначаются согласно их положению на
хромосоме.
D16S539
D – ДНК
16- хромосома
S – единичная копия последовательности
539- 539 локус описанный на хромосоме 16
D16S539
D – ДНК
16- хромосома
S – единичная копия последовательности
539- 539 локус описанный на хромосоме 16
Слайд 50Выбор ДНК-маркеров
Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах )
Расположенные близко к исследуемому гену.
Фланкирующие ген с теломерной и центромерной сторон
Слайд 51
Н
М
A1
A2
A3
A4
Н
A1
A3
М
A2
A4
Н
М
A1
A2
A4
A3
Расстояние оценивают в сантиморганидах (1СМ –1%- 1000 000 пн)
Чем ближе расположены
маркеры к гену, тем теснее они сцеплены, тем ниже процент ошибки
Слайд 55ДНК-диагностика
по возможности использовать несколько подходов к диагностике (например, прямые и косвенные)
анализ
семейного материала даже в случае прямой диагностики
Контроль воспроизводимости результатов
Контроль на загрязнение плодного материала материнским
Контроль воспроизводимости результатов
Контроль на загрязнение плодного материала материнским
Слайд 56Болезни экспансии тринуклеотидных повторов
Экспансия кодирующих тринуклеотидных повторов
CAG-повторы – полиглутаминовые тракты
Хорея Гентингтона
GCG,GCA,GCT,GCC-повторы-
полиаланиновые тракты
1. Небольшое количество повторений при патологии
2. Новыя функция белка
3. Цитотоксический эффект
GCG,GCA,GCT,GCC-повторы-
полиаланиновые тракты
1. Небольшое количество повторений при патологии
2. Новыя функция белка
3. Цитотоксический эффект
Экспансия не кодирующих тринуклеотидных повторов
Различные триплеты
Синдром Мартина-Белл
(УО FRAXA, FRAXE, FRAXF)
1. Большое количество повторений
2. Расположены в регуляторных областях
Слайд 57Синдром Мартина-Белл
- Нормальное телосложение
Широкий лоб
Удлинненное лицо
Крупные оттопыренные уши
Страбизм (косоглазие)
Высокое арочное нёбо
Гиперэластичность суставов
Мозоли (аутоагрессия)
Пролапс митрального клапана
Макроорхизм
Гипотония
Мягкая эластичная кожа
Плоскостопие
Судороги (~10%)
Аутизм
Умственная отсталость
Высокое арочное нёбо
Гиперэластичность суставов
Мозоли (аутоагрессия)
Пролапс митрального клапана
Макроорхизм
Гипотония
Мягкая эластичная кожа
Плоскостопие
Судороги (~10%)
Аутизм
Умственная отсталость
Слайд 62Проявлением синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы) является экспансия тринуклеотидного повтора (CGG)n, расположенного
в промоторной области гена FMR1 (Xq27.3)
Причиной синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы) является аномальное метилирование промоторной области гена FMR1 (Xq27.3)
Слайд 64Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Мартина-Белл
М 1 2
3 4 5 6 7 8
1- ДНК нат., 2 –ДНК HpaII
1,2 – пациент FRAX; 3,4 – нормальный мужчина; 5,6 - пациент FRAX; 7,8 – нормальный мужчина
Слайд 68 М образец
1 образец 2
CpG (CGG)n СpG (CGG)n
CpG (CGG)n СpG (CGG)n
- неметилированный промотор FMR1
– метилированный промотор FMR1
– метилированный промотор XIST
– неметилированный промотор XIST
(CGG)1-55
1 – здоровая девочка, повтор CGG в гетерозиготном состоянии в пределах нормы.
2 – пациентка с полной мутацией FMR1: превышение интенсивности сигнала метилированного промотора FMR1 при сохранении соотношения метилированный/неметилированный промотор XIST; один аллель CGG-повтора в пределах нормы, второй (соответствующий полной мутации) не амплифицируется.
М – маркер молекулярного веса.
Анализ метилирования промотора и длин CGG-повтора гена FMR1 у пациентов женского пола методом метилспецифической ПЦР.
Слайд 69Диагностика синдрома Мартина-Бепп
1 2
3 4 5 6 7 8 9
п м п м п м п м п м п м п м п м п м М
п м п м п м п м п м п м п м п м п м М
1,2,4,9 – нормальные женщины
3 – женщина с полной мутацией FMR1 и аномальным метилированием промотора
5,6,7,8 – семья с FRAX, 5 – мать с премутацией, 6 – больной сын с полной мутацией FMR1 и аномальным метелированием промотора, 7 – здоровая сестра пробанда без носительства, 8 - отец
н/м FMR1
м XIST
м FMR1
н/мXIST
Слайд 70Диагностика синдрома Мартина-Белл
Исследование кариотипа пробанда для исключения хромосомной патологии, не имеющей
отношения к СМБ
Анализ состояния метилирования промоторной области FMR1 у больных без выраженной хромосомной патологии: методом МЧ-ПЦР для больных мужского пола и методом блот-гибридизации по Саузерну для больных женского пола
Анализ ДНК родственников выявленных больных с СМБ для определения носителей премутаций и полных мутаций. Метод выбора – анализ сцепления по фланкирующим STR-маркерам.
Пренатальная диагностика по STR-маркерам на любом сроке беременности. В случае мужского пола плода – методом МЧ-ПЦР на ДНК из клеток амниотической жидкости или периферической крови плода.
Анализ состояния метилирования промоторной области FMR1 у больных без выраженной хромосомной патологии: методом МЧ-ПЦР для больных мужского пола и методом блот-гибридизации по Саузерну для больных женского пола
Анализ ДНК родственников выявленных больных с СМБ для определения носителей премутаций и полных мутаций. Метод выбора – анализ сцепления по фланкирующим STR-маркерам.
Пренатальная диагностика по STR-маркерам на любом сроке беременности. В случае мужского пола плода – методом МЧ-ПЦР на ДНК из клеток амниотической жидкости или периферической крови плода.
