Биохимический моделист-конструктор презентация

Предшественниками синтеза служат относительно небольшое количество первичных метаболитов.
Синтез четко спланирован и обслуживается набором специальных ферментов, причем некоторые из них весьма специфичны, а некоторые – нет
Для многих групп вторичных метаболитов существует несколько путей их синтеза. Часто этапы синтеза дублированы в разных компартментах клетки (например, пластиды – цитозоль).

которой затем формируются многочисленные варианты.
Принципы формирования «скелета» различны для разных групп вторичных метаболитов.
Для изопреноидов – формирование гибких цепочек разной длины - 10, 15, 20, 30, 40 атомов углерода (пренилтрансферазы), а затем сворачивание их в разнообразные циклы (циклазы).
Для алкалоидов – формирование гетероциклов за счет конденсации аминоальдегидов и/или аминокетонов, получаемых из аминов (аминооксидазы), которые в свою очередь формируются из аминокислот (декарбоксилазы)

«Декорирование» может кардинально менять биологическую активность молекулы.
У арабидопсиса в геноме:
Найдено более 300 (!) генов различных изоформ цитохрома Р450. Трансгенные растения арабидопсиса и табака с двумя чужеродными генами «цианогенных» цитохромов синтезировали цианогенные гликозиды.
Найдены гены более 100 диоксигеназ. Диоксигеназы участвуют в биосинтезе алкалоидов, флавонидов, гиббереллинов, этилена. Для них характерна широкая субстратная специфичность - возможность использовать разные субстраты и образовывать несколько продуктов.

генов. Ацилтрансферазы вторичного метаболизма у разных видов структурно близки и имеют консервативный гистидин-содержащий мотив. Структурно они также похожи на ацилтрансферазы первичного метаболизма. Гены ацилрансфераз в арабидопсисе собраны в кластеры на 5 хромосоме, тогда как гены диоксигеназ разбросаны по геному
Метилтрансферазы. O-, C-, N-и S- метилтрансферазы, метилируют флавониды, изопреноиды, алкалоиды, полиамины, поликетиды. C-, N-и S- метилтрансферазы эволюционно не связаны, О-метилтрансферазы представляют одну группу и имеют консервативный SАМ-связывающий мотив.
Гликозилтрансферазы. O-, C-, S- гликозилтрансферазы.

TR-1, tropinone reductase 1
BBE, berberine bridge enzyme;
CYP80B1, ( S)-Nmethylcoclaurine 3′-hydroxylase;
TYDC, tyrosine decarboxylase.

desacetoxyvindoline 4-hydroxylase;
DAT, acetyl-CoA:4-O-deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase;
DXS, D-1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase;
G10H, geraniol 10-hydroxylase;
SGD, strictosidine β-D-glucosidase;
SLS, secologanin synthase;
STR, strictosidine synthase;
TDC, tryptophan decarboxylase;
T16H, tabersonine 16-hydroxylase.

в пластидах.

пренил-трансфераз
100 – 200 циклаз
200 – 300 «декорирующих» ферментов
(оксигеназ, гидроксилаз, метил-, гликозил-, ацил-трансфераз)

(юбилей!), из ячменя, МВ ~ 330 kDa, гомотетрамер, Опт. рН ~ 8,8, без кофакторов. Структурно сходна с гистидин-аммиак-лиазой из Pseudomonas putida.
Ряд изоформ. Как минимум две – ФАЛ1 ингибируется кофейной и феруловой кислотами, ФАЛ2 – бензойными кислотами.
Кодируется мультигенным семейством. У Arabidopsis thaliana – 4 гена. Считается растворимым ферментом, однако известны цитоплазматическая и мембрано-связанные изоформы. Предполагается ее ассоциация с гидроксилазой коричной кислоты (С4Н), ассоциированной с ER.
Активируется многими факторами (патогены, УФ).
Для травянистых растений – распространена тирозин-аммиак лиаза (ТАЛ, TAL).
Гидроксилаза коричной кислоты (С4Н, САН). Цитохром-Р450 монооксигеназа. CYP73A1. Известно более 80 цитохром-Р450 семейства CYP73А1, но не все имеют активность С4Н
Мультигенное семейство, Два класса, существенно различающиеся по а-к последовательности, I – для однодольных, II – для двудольных.
Гены клонированы, пробовали их экспрессировать в дрожжах…
Кумарат-СоА-лигаза (4CL). Два класса, I и II. У арабидопсиса – 11 генов, но не все белки проявляют активность. Клонированы, экспрессированы в дрожжах…

synthase
(CHS),
4-coumaroyl:CoA-
ligase (4CL),
dihydroflavonol
4-reductase (DFR),
7,29-dihydroxy, 49-
methoxyisoflavanol
dehydratase (DMID),
flavanone 3-
hydroxylase (F3H),
flavone synthase
(FSI and FSII),
flavonoid 39
hydroxylase (F39H)

вариабельный гидрофобный N-концевой участок (синий), консервативные трансмембранные домены (оранжевые), вариабельные линкерные участки (зеленый и фиолетовый) и консервативный обращенный в цитозоль С-концевой каталитический домен (желтый). Изоформы HMGR, которые определяют синтез вторичных метаболитов после действия элиситоров (сесквитерпеноидных фитоалексинов) отличаются по N-концевому домену и гликозилированы в люмене ЭР.

цитозоль, ЭР, пластиды.
Накопление: вакуоль, периплазматическое пространство

Флуоресценция стероидных гликозидов в клетке
Dioscorea deltoidea in vitro

уровне интактного растения.

Синтез стероидных гликозидов происходит в листьях в водорастворимой (фуростаноловой) форме.
Транспорт осуществляется по флоэме.
Накопление происходит в эпидермальных тканях листьев и стеблей в фуростаноловой форме, в корневищах – в паренхиме в водонерастворимой спиростаноловой форме
Фуростаноловый и спиростаноловые гликозиды отличаются наличием лишь одного остатка глюкозы, но кардинально - по биологической активности.

(A.belladonna)
TR-1 (тропинон редуказа) – локализация в эндодерме и наружном кортексе корня белены (иммунологический анализ)
H6H (гиосциамин -6β-гидроксилаза) – в перицикле корня белены (иммунологический анализ)
Синтез алкалоидов наблюдается только в кончиках молодых корней
(1 – 3 см)

локализованы в
клетках верхнего и нижнего
эпидермиса листа.
D4H (дезацетоксивиндолин –гидроксилаза
DAT (деацетилвиндолин
4-О-ацетилтрансфераза) – экспрессируются в идиобластах и млечниках листа.
TDC и STR-1 также экспрессируются в в протодерме корня и кортикальных клетках корня вокруг апикальной меристемы.
Синтез идет только в молодых листьях и корнях.

жирных кислот:
согласованная работа многих органелл;
две ацетил-КоА-карбоксилазы:
прокариотческого типа в пластидах,
эукариотического – в цитозоле.

Синтез флавоноидов:
параллельная работа шикиматного пути в пластидах и цитозоле

Синтез изопреноидов ??

и «альтернативный» (от эубактерий) в пластидах.

Моно- сескви- и тритерпеноиды синтезируются по «классическому»
пути в цитозоле клетки
Моно- ди- и тетратерпеноиды - по «альтернативному» в пластидах
Всегда ли?

«фабрика опасных и энергоемких производств» клетки:
Фотосинтез,
Восстановление нитритов и сульфатов,
Синтез всех жирных кислот,
Синтез аминокислот, пуринов, пиримидинов,
Синтез вторичных метаболитов.

Вакуоли:
Место хранения многих метаболитов, в том числе вторичных (запасающие вакуоли),
Место разрушения метаболитов (литические вакуоли)

тимьяна. Круглые структуры - пельтатные железистые волоски (трихомы), в которых синтезируются моно- и сесквитерпены.
B Световая микрофотография железистого волоска мяты, показанного в продольном сечении. C – субкутикулярное пространство; S, секреторные клетки; St - ножка; B, базальная клетка; E, эпидермальная клетка.
C. Световая микрофотография секреторной полости в листе лимона, показанной в поперечном сечении. L, люмен; Sh, клетки футляра; P, клетки паренхимы.
D. Световая микрофотография смоляного хода в древесине сосны Джеффра, показанной в поперечном сечении X, вторичная ксилема.

из бензилбензоата является светозависимым процессом.

Orlova et al. (2006) Plant Cell 18

темноте основной вклад в формирование бензоидов вносит
путь синтеза, начинающийся не из фенилаланина…

Orlova et al. (2006) Plant Cell 18

а в E. coli ввели гены моноамин оксидазы (MAO), норкоклуарин синтазы (NCS), норкоклаурин 6-O-метилтрансферазы (6OMT), коклаурин--N-метилтрансферазы (CNMT) и 3’-гидрокси-N-метилкоклаурин-4’-O-метилтрансферазы (4’OMT). В результате в клетках E. coli был получен синтез коклаурина. Важно, что в экспериментах были использованы гены двух изоформ NCS, но только одна из них показала высокий уровень экспрессии в E. coli.

(CYP80G2, коритуберин-синтаза) вместе с генами CNMT и берберин-формирующего энзима (BBE) из Coptis japonica. Трансгенные дрожжи выращивали на среде, содержащей коклаурин, экскретируемый трансгенными клетками E. coli. Показали, что клетки дрожжей содержат магнифлорин и скоулерин. Конечная продуктивность – 55 мг/л (S)-ретикулина, 7,2 мг/л магнифлорина и 8,3 мг/л скоулерина.

из Thalictrum flavum, Papaver somniferum и A. thaliana привела к синтезу (S)-скоулерина, (S)-тетрагидроколумбамина и (S)-тетрагидроберберина из (S)-ретикулина. Любопытно, что экспрессия человеческой цитохром-Р450-оксидазы вместе с соответствующей редуктазой привела к формированию из ретикулина салютаридина, показав новую активность введенного фермента…

были введены в Saccharomyces cerevisiae. Было показано, что ферменты, кодируемые гетерологичными генами, с успехом используют предшественники синтеза изопреноидов дрожжей. Это привело к образованию в клетках дрожжей таксадиена (1 мг/л) и таксадиен-5α-ола (более 25 мкг/л). Однако биосинтез прерывался на стадии гидроксилирования, осуществляющегося цитохром-Р450-оксидазой THY10b…

синтазы, аморфадиен-оксидазы и цитохром Р450-редуктазы - биосинтез от фарнезил-дифосфата до артемизиновой кислоты. Получили артемизиновую кислоту более 100 мг/л.

ввели «сборную солянку» генов –
Фенилаланин-аммаик лиазу (PAL) из Rhodotorula rubra
4-Кумарил-KоА-лигазу 4CL из S.coelicor
Халконсинтазу CHS из Glycyrrhiza echinata
Халконизомеразу CHI из Pueraria lobata

Флавоноидов получили мало, но получили.
Однако после оптимизации и всяческих доработок - 700 mg/л флавононов 113 mg/л антоцианинов…

(вторичные метаболиты – «отходы производства»)
Вторичные метаболиты – запасные соединения
Вторичные метаболиты – защитные соединения
Вторичные метаболиты – «биохимические инструменты» взаимодействия растения с окружающей средой

Но как это доказать ?

доказать защитную роль вторичных метаболитов, участвующих в работе третьего круга обороны: фитоалексины

в корнях овса, его нет у пшеницы и ячменя. Мощная защита от патогенного гриба Gaeumannomyces graminis var. tritici, который поражает пшеницу и ячмень, но никогда – овес. У гриба Gaeumannomyces graminis var. avenae есть фермент авенациназа, который удаляет концевые глюкозы и делает молекулу нетоксичной - и этот гриб прекрасно «кушает» овес…

Примеры защитных соединений «первого круга» обороны.

мирцен, камфен, пиретрин-1
аллелопатические свойства: лимонен, цинеол, карвон, камфора
реппеленты: ментол, непаталактон. α-пинен
против травоядных: 1,8-цинеол

Но – линалоол – привлечение опылителей…

Механическое повреждение – в смоле пихты изменяется содержание пинена, каурена, мирцена.
У устойчивых к абиотическому стрессу растений (загрязнение атмосферы) – много камфена и лимонена, но мало β-пинена, у неустойчивых – наоборот.
После стресса (обработка SO2) – в 5 – 10 раз повышается содержание камфена, α- и β-пинена.

Viruses IC50 (%; ppm) References
Herpes simplex virus ( HSV; DNA virus)
Aloysia gratissima HSV-1 65 ppm Garcia et al. (2003)
Artemisia douglasiana HSV-1 83 ppm Garcia et al. (2003)
Citrus limon HSV-1 0.0015% Koch (2005)
Eucalyptus globulus HSV-1 0.009% Schnitzler et al. (2001)
HSV-2 0.008% Schnitzler et al. (2001)
Eupatorium patens HSV-1 125 ppm Garcia et al. (2003)
Houttuynia cordata HSV-1 0.0013% Hayashi et al. (1995)
Hyssopus officinalis HSV-1 0.0001% Koch (2005)
HSV-2 0.0006% Koch (2005)
Illicium verum HSV-1 0.004% Koch (2005)
HSV-.2 0.003% Koch (2005)
Leptospermum HSV-1 0.0001% Reichling et al. (2005
scoparium HSV-2 0.00006% Reichling et al. (2005
Matricaria HSV-1 0.00003% Koch (2005)
recutita HSV-2 0.00015% Koch (2005)
Melaleuca alternifolia HSV-1 0.0009% Schnitzler et al. (2001)
HSV-2 0.0008% Schnitzler et al. (2001)
Mentha piperita HSV-1 0.002% Schuhmacher et al. (2003)
HSV-2 0.0008% Schuhmacher et al. (2003)
Pinus mugo HSV-1 0.0007% Koch (2005)
HSV-2 0.0007% Koch (2005)
Santalum album HSV-1 0.0002% Koch (2005)
HSV-2 0.0005% Koch (2005)
Tessaria absinthioides HSV-1 105 ppm Garcia et al. (2003)
Thymus vulgaris HSV-1 0.001% Koch (2005)
HSV-2 0.0007% Koch (2005)
Zingiber officinale HSV-1 0.0002% Koch (2005)
HSV-2 0.0001% Koch (2005)

– ферромон тревоги насекомых

Дитерпены:
кауреновая и трахилбановая кислоты (цветки подсолнечника) – гибель личинок бабочек
Паклитаксел (тис) – яд для животных

Тритерпеноиды:
сердечные гликозиды - яд для животных
Экдистероиды – нарушение развития насекомых.

белое пятно на стволе - место нападения жуков и выделения смолы из поврежденного ими участка.
Дерево пережило атаку жуков, так как содержание токсичных компонентов эфирного масла, содержащихся в смоле, было достаточно, чтобы убить короедов, которые были затем “удалены” оттоком смолы. После испарения эфирных масел и воздействия воздуха, дитерпеновые смоляные кислоты затвердевают и формируют «пробку», которая «запечатывает» рану.

действие – на земляных червей и кроликов
Гипнотическое действие – на мышей.
Кумарины с аминоалкильным заместителями – стимулируют ЦНС.
Псорален, бергаптен – яды для рыб.
Псрален – аллелопатическое действие.

Южные широты – в качестве заместителей – изопреноиды.
Средние широты – кумарины, обогащенные кислородом.
Северные широты – гликозиды, сложные эфиры, метокси- окси-группы.

Псорален – фотосенсибилизатор. 270 и 360 нм.
5 мг на кожу – УФ лампа – через 5 минут сильный ожог.

Граница распространения – между 45 и 55о с.ш.
Севернее – он не встречается. К югу – число видов с псораленом увеличивается.

делать?

Один из возможных подходов –
использование культур клеток высших растений

делать?

Снятие организменного
контроля развития -
переход к популяционным
механизмам развития системы
Отбор клеток по максимальной и/или устойчивой пролиферации основной принцип развития поуляции
гетерогенность системы по
различным признакам
основа адаптационных возможностей системы
Узкие адаптационые возможности системы
следствие отсутствия длительной эволюции

Большой невостребованный
генетический материал –
клетки in vitro имеют полную
информацию об интактном
растении
Влияние невостребованных
генов на развитие популяции
Судьба невостребованного генетического материала –
возникновение и скорость
мутаций, сомаклональных
вариаций
Включение/выключение невостребованных блоков –
программы морфогенеза,
соматического эмбриогенеза

Основные свойства культуры клеток высших растений - экспериментально созданной популяции соматических клеток

Один из возможных подходов – использование культур клеток высших растений

количестовм пластид

синтеза метаболитов
не получен синтез морфинанов, димерных индольных алкалоидов, карденолидов.
Различия в синтезе по классам соединений
добиться синтеза фенольных соединений и изопреноидов проще, чем алкалоидов
Различная стабильность синтеза для разных соединений при длительном субкультивирвоании. Стабильный синтез соединений, способствующих пролиферации клеток.
Различные закономерности синтеза в цикле культивирования. Часто синтез активируется при замедлении роста культуры, реже – во время активной пролиферации клеток.

клетки табака в суспензии







Биохимическая - флуоресценция клеток диоскореи в культуре

Генетическая - различное число хромосом в клетках женьшеня











перестройки хромосом в клетках пшеницы

стероидные гликозиды
Panax ginseng, P. japonicus, тритерпновые гликозиды
P.quinquefolius (гинзенозиды)
Serratula coronata, экдистероиды
Ajuga reptans
Stevia rebaudiana дитерпеновые гликозиды
(стевиол-гликозиды)
Polyscias filicifolia тритерпеновые гликозиды

стероидные гликозиды, характерные как для листьев (протодиосцин), так и для корневища (дельтозид) интактного растения. Кроме того появляются 26-S-изомеры, не характерные для интакнтого растения.

S-

в - молодая каллусная культура,
1 - 20-гидроксиэкдизон; 2 - инокостерон; 3 - макистерон А; 5 - экдизон;

ВЭЖХ хроматограммы экдистероидов интактного растения и культур клеток серпухи Serratula coronata

Состав экдистероидов длительно культивируемого каллуса приближается к составу этих соединений в листьях растения

в - молодая каллусная культура,
1 - полиподин В; 2 - 20-гидроксиэкдизон; 3 - 29-норциастерон;
4 - 29-норсенгостерон; 5 - сенгостерон; 6 - аюгалактон; 7 - аюгастерон В;

на двух разных средах

%

%

Среда ТО

Среда 62

содержание гинзенозидов




Соотношение Rg/Rb групп

R1: Glu
R2: Glu- Glu

Ребаудиозид А = R1: Glu
R2: Glu- Glu
|
Glu

Ребаудиозид С = R1: Glu
R2: Glu- Rha
|
Glu

(mg/g)

1. Intact plant 1. Callus culture
2. Plant in vitro 2. Suspension culture
3. “Roller” plant 3. Morphogenic callus
4. Shoots from morphogenic callus

Миксотрофная каллусная культура













Гетеротрофная каллусная
культура