Анализ нуклеиновых кислот. Молекулярное клонирование презентация

Содержание

Молекулярное клонирование Этапы Вырезание интересующего участка ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) Встраивание его в вектор с помощью ДНК-лигаз Введение рекомбинантной ДНК в клетку

Слайд 1 Анализ нуклеиновых кислот Занятие 1

Слайд 2Молекулярное клонирование
Этапы
Вырезание интересующего участка ДНК с помощью
эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз)

Встраивание его в вектор с помощью ДНК-лигаз

Введение рекомбинантной ДНК в клетку

Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК

Слайд 3Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
- 3 субъединицы: R, M, S – до 700

кДа
- требуют ATP, SAM, Mg2+
- разрезают на значительном и случайном
расстоянии от сайта узнавания

гомодимеры ≈2×30 кДа
- требуют только Mg2+
разрезают в пределах сайта узнавания
в сторго определенном месте

по строению напоминает I тип
требуют ATP, Mg2+
разрезают на расстоянии ≈24–27 нуклеотидов
от сайта узнавания

Разделяют на 3 типа:

I




II




III

Слайд 4Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGGATCCNN-3’
3’-NNCCTAGGNN-5’
5’-NNAGATCTNN-3’
3’-NNTCTAGANN-5’
BamH I
Bgl II
5’-NNNGATCNNN-3’
3’-NNNCTAGNNN-5’
Mbo I
5’-NNNGATCNNN-3’
3’-NNNCTAGNNN-5’
Dpn I
*

*

*

*

Слайд 5Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
Изошизомеры – рестриктазы, узнающие одинаковые сайты.
GATC

Mbo I –

A не метилирован
Dpn I – A метилирован
Sau IIIa – наличие метилирования A безразлично

Гетерошизомеры – изошизомеры, разрезающие
по-разному.

Пример: Mbo I и Dpn I

Слайд 6Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGAATTCNN-3’
3’-NNCTTAAGNN-5’
EcoR I
pH 7.3, NaCl, MgCl2
*

*

Слайд 7Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGAATTCNN-3’
3’-NNCTTAAGNN-5’
EcoR I
pH 7.3, NaCl, MgCl2
5’-NNNAATTNNN-3’
3’-NNNTTAANNN-5’
Вторичная («штриховая») активность:
↓[NaCl], Mg →

Mn

*

*

Слайд 8Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’
HgaI (подтип IIS)
5


10

Слайд 9Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’
HgaI (подтип IIS)
5


10
Разрезание 1-цепочечной

ДНК в нужном месте

Слайд 10Молекулярное клонирование
ДНК-лигазы
Наиболее распространенная – из фага T4
Соединяет 5’-фосфат и

3’-OH
Требует ATP, Mg2+
Лигирует липкие и тупые концы

Слайд 11Молекулярное клонирование
Методы получения рекомбинантных ДНК
Коннекторный
Рестриктазно-лигазный
С помощью линкеров

Слайд 12Молекулярное клонирование
Векторы
В качестве векторов используются
плазмиды

хромосомы вирусов

фрагменты эукариотических хромосом

Слайд 13Молекулярное клонирование
Векторы
Необходимые свойства векторной молекулы
Возможность встраивания чужеродной ДНК

Способность размножаться

в клетках хозяина
и передаваться в следующие поколения

Наличие селектируемых маркеров

Желательно для вектора на основе плазмиды:

Ослабленный контроль репликации

Слайд 14Молекулярное клонирование
Введение рекомбинантной ДНК в клетку –трансформация
Биологические
- вирусы

- клеточные рецепторы

Химические
- ионы металлов
(Ca2+, Rb2+)
- диэтиламиноэтил-декстран
- липосомы

Физические
- электропорация
- лазер

Механические
- микроинъекция
- бомбардировка

Методы:

Слайд 15Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Гены устойчивости к антибиотикам
Гены

ферментов

Слайд 16Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Маркер на основе гена LacZ из

лактозного оперона

β - галактозидаза

Слайд 17Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
X-gal (5-бром-4-хлор-3-индоил-β-D-галактопиранозид)

Слайд 18Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Маркер на основе гена LacZ из

лактозного оперона

В плазмидном векторе:
LacZ’ – 5’-концевой участок LacZ → α-донор

В клетке:
мутация в 5’-концевой области LacZ → α-акцептор


Взаимная комплементация

Слайд 19Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pBR322

Слайд 20Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Слайд 21Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Слайд 22Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Слайд 23Полимеразная цепная реакция
.

Слайд 24Полимеразная цепная реакция
.
Компоненты:

ДНК-матрица
Два праймера, комплементарные концам
интересующего

фрагмента
Термостабильная ДНК-полимераза
Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты
Буферный раствор

Слайд 25Полимеразная цепная реакция
.
minutes

Слайд 26Выделение плазмидной ДНК
Метод щелочного лизиса Бирнбойма–Доли
Лизоцим → разрушение

клеточной стенки
SDS → разрушение мембраны
pH 12 → денатурация хромосомной ДНК
pH 5 → ренатурация плазмидной ДНК
центрифугирование

Слайд 27Определение концентрации НК
Фотометрическая абсорбция
- максимум поглощения при 260 нм

Похожие презентации

Систематика и номенклатура возбудителей бактериальных инфекций 456
Оплодотворение и дробление 1232
Семейство лилейные 303
Голос. Голосовой аппарат 668
Адаптации к различным метаболическим состояниям 404
Животный мир Краснодарского края 294

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое ThePresentation.ru?

Это сайт презентаций, докладов, проектов, шаблонов в формате PowerPoint. Мы помогаем школьникам, студентам, учителям, преподавателям хранить и обмениваться учебными материалами с другими пользователями.

Для правообладателей

Яндекс.Метрика