ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения презентация

Звенигород

повышенный интерес, публикации, монографии: - Типирование нечеловеческой ДНК (Coyle, 2008)
- Судебная микробиология (Budowle, 2011)
- Рекомендации ISFG (2011)

США по числу домашних животных на душу населения: 33% семей содержат кошек (25-30 млн. кошек), 20% семей содержат собак (20 млн. собак).

При проникновении в помещение с домашним животным неизбежна «контаминация» шерстью (D’Andrea, 1998) -> возможность привязки к месту преступления либо хозяину животного (мтДНК, реже STR).

Животные-нарушители: нападения на людей -> доказательство виновности или невиновности (Австралия: 4 миллиона собак, ~ 100 000 нападений на людей, большинство не раскрыто)

Животные-жертвы: случаи жестокого обращения с животными

Tom 2010; Berger, 2008; van Asch 2008).
Опубликованы мультиплексы:
DogFiler – 16 локусов (Wictum, 2013)
Mini-DogFiler 3 мультиплекса с мини STR(Kun, 2013)
Работают на волках, лисах, койотах

Иерусалим - c 2012 база данных
Генотипирование экскрементов Штраф > 100 USD
Премия – упаковка корма
Ранее в Петах-Тикве.

панель из 11 локусов.
Реализовано – MeowPlex (Butler, 2002).

MewPlex: 11 STR + SRY PD = 5,5 X 107 - 3,3 X 1013

растений. Возможно при условии уникального видового состава растительности.

1993 год – два семени дерева Parkinsonia aculeata с места преступления в багажнике пикапа подозреваемого – доказательство вины. (Yoon, 1993)

2. Географическое происхождение наркотиков (марихуана)
Возможность отследить связь пользователя с дилером и производителем. Типирование высокополиморфных STR-маркеров позволяет различить даже инбредные линии. Возможен анализ смесей. (Hsieh, 2003).
Возможно создание базы данных.

divinorum

gasseri специфичны для вагинальных секретов– возможность идентификации вагинальных выделений. Менструальное происхождение крови.

Streptococcus – обнаруживаются только в ротовой полости человека – слюна, отличить кровь из ротовой полости от другой крови (Donaldson, 2010)

Видовой состав бактерий и грибов почвы, найденной на одежде или обуви может дать привязку к конкретной местности.

Биотероризм. Октябрь 2001 –атака на правительственные учреждения США.
22 почтовых конверта с сибирской язвой -> 5 человек погибло.
125 000 конвертов были протестированы на отсутствие сибирской язвы.
ФБР – рабочая гурппа по судебной микробиологии (Budowle)

Личинки насекомых Diptera – привязка трупа к месту преступления. Определение давности трупа по стадии развития личинок.

или животное?
Незаконная торговля редкими и исчизающими видами (годовой оборот 20 млрд.$ в год).

Агрессия диких животных (нападение на людей, домашних животных).

Случаи незаконной охоты на диких животных.

пригоден, высокая внутривидовая изменчивость
мтДНК ген Цитохрома b - наиболее удобен для идентификации видов позвоночных (Parson, 2000), позволяет дискриминировать даже близкие виды

мтДНК – ген 12S рРНК – слишком консервативен. Информативно ~150 bp

мтДНК – ген COI – консервативен, выбран проектом Barcode of life 648 bp

2. Анализ последовательности мтДНК:
- Сравнение с референсными образцами;
- Поиск гомологии в GeneBank;
- Сравнение с референсной базой данных (Barcode of life)

референсные образцы из надежного источника. Последовательности выравниваются
Проводится филогенетический анализ

в базе GeneBank
GeneBank - Нереферируемая база данных, может содержать ошибки

определение видовой принадлежности

Мишень: участок контрольного региона мтДНК –> высокий межвидовой полиморфизм по длине.
Высокая чувствительность. Универсальный набор для всех млекопитающих.
Применение: анализ неопознанных останков, преступления против дикой природы, смешанные образцы

данных.
BOLD - Barcode Of Life Database - http://www.boldsystems.org/
Задача проекта – создание наиболее полного каталога всех видов планеты.
Используется участок 648 bp гена COI.

Собрано видов (2012):
животных: 114 098
растений: 39 730
грибов и др. 2 366

Шайхаев Е.Г., Шитова М.В.
2013, Биология моря

Маркер молекулярной массы
1, 2 – Горбуша , 139 п.н.
3, 4 – Кета, 155 п.н.
5, 6 – Гибрид горбуши и кеты, 139, 155 п.н.
7, 8 – Кижуч, 160,164 п.н.

Определение видовой принадлежности с помощью секвенирования мтДНК
2) Идентификация особи с использованием STR-маркеров.
Если нет информации о последовательностях – секвенирование мтДНК.

диких животных (п. а ч.1 ст. 258 УК РФ):

326 образцов:
283 образца мышечной ткани;
4 образца волос с луковицами;
3 образца шкур (один лось, два бурых медведя);
36 образцов, собранных с вещественных доказательств (перчатки, топор, смывы с вездехода и т.д.)
Задача:
Определить видовую принадлежность образцов, изъятых при осмотрах мест происшествий;
Определить количество особей, которым принадлежат изъятые образцы;
Сравнить генотипы особей с генотипами на вещественных доказательствах

Работа проводилась совместно с
ООО «Центр Молекулярной Генетики», МГНЦ РАМН

ISFG:
10 образцов бурого медведя (Ursus arctos)
10 образцов лося (Alces alces)
предоставлены Институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН
Определение видовой принадлежности:
анализ нуклеотидной последовательности участка гена цитохрома b мтДНК позиции 1 - 402 п.н.;
филогенетический анализ полученных последовательностей с привлечением референсных образцов;
поиск гомологии в GeneBank для образцов, не кластеризующихся с референсными образцами.

гаплотипы следующих видов:
лось (Alces alces) - 274 образца ;
бурый медведь (Ursus arctos) - 18 образцов;

- дикий кабан или домашняя свинья (Sus scrofa) - 1 образец ;
корова (Bos taurus) – 3 образца;
человек (Homo sapiens) – 6 образцов

Сиквенс

Выравнивание

Дерево

В кластерах с референсными образцами

Определялись через Blast

scrofa);
- Неразличимы на основе нуклеотидных последовательностей мтДНК гена цитохром b;

динуклеотидные маркеры.
Создан мультиплекс из 7 маркеров:

Andreassen et al., 2012, 13 динуклеотидных маркеров

исследован слабо.
Обычно адаптируются маркеры, описанные для коровы Bos taurus (разные семейства) -> низкополиморфные маркеры.

Создан мультиплекс:
4 высокополиморфных динуклеотидных STR-маркера и маркер пола,
Cervid 1 оказался мономорфным

референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации;
в исследованных 18 образцах выявлено 2 генотипа (т.е. минимум 2 особи);
в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения.

лось (Alces alces)
- 10 разных генотипов в 10 референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации;
в исследованных 268 образцах выявлено 9 генотипов (т.е. минимум 9 особей);
в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения.